Solubilizace, purifikace a příprava rekonstitučního systému pro lidský enzym 17beta-hydroxysteroiddehydrogenasu typu 3

Abstract

Univerzita Karlova Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Mgr. Tereza Zahradníková Školitel: Prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. Konzultant: RNDr. Lucie Zemanová, Ph.D., PharmDr. Adam Skarka, Ph.D. Název rigorózní práce: Solubilizace, purifikace a příprava rekonstitučního systému pro lidský enzym 17beta-hydroxysteroiddehydrogenasu typu 3 Nadrodina dehydrogenas/reduktas s krátkým řetězcem je rozsáhlá skupina NADP(H)/NAD(H)-dependentních oxidoreduktas. Lidské SDR enzymy jsou klasifikovány do 47 rodin, zahrnující cytosolické a membránově vázané enzymy. Jedním z nich je lidský membránový enzym 17β-hydroxysteroiddehydrogenasa typu 3 (17β-HSD3), který se účastní biosyntézy steroidních hormonů, především katalyzuje přeměnu androstendionu na testosteron. Cílem této práce bylo najít vhodný detergent pro úspěšnou solubilizaci rekombinantní formy 17β-HSD3, následně získat čistou formu enzymu a připravit rekonstituční systém, který by umožnil další studium enzymu 17β-HSD3. Mikrosomy obsahující rekombinantní formu 17β-HSD3 enzymu byly izolovány z hmyzích Sf9 buněk (Spodoptera frugiperda). Prvním krokem byl solubilizační proces, který zahrnoval screening detergentů. Bylo testováno šest detergentů v různé koncentraci: ASB 14-4, C12E8, DDM, CHAPS, Igepal CA-630 a Triton X-100. Pro...

Charles University Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Biochemical Sciences Candidate: Mgr. Tereza Zahradníková Supervisor: Prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. Consultant: RNDr. Lucie Zemanová, Ph.D., PharmDr. Adam Skarka, Ph.D. Title of rigorous thesis: Solubilisation, Purification and Reconstitution of Human 17beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 3 Short-chain dehydrogenase/reductase superfamily is a large group of NADP(H)/NAD(H)-dependent oxidoreductases. Human SDR enzymes are classified into 47 families, including cytosolic and membrane-bound ones. One of them is a human membrane-bound enzyme 17β-hydroxysteroid dehydrogenase type 3 (17β-HSD3), which participates in the biosynthesis of steroidal hormones and mainly catalyses the conversion of androstenedione to testosterone. The aims of this study were to find a suitable detergent for successful solubilisation, to purify the enzyme and to prepare a reconstitution system for further study of the 17β-HSD3 enzyme. Microsomes containing overexpressed 17β-HSD3 were isolated from Sf9 insect cells (Spodoptera frugiperda). The first step was the solubilisation process, which involved detergent screening. Six detergents at different concentrations were tested: ASB 14-4, C12E8, DDM, CHAPS, Igepal CA-630 and Triton X-100. The detergent ASB...