Stanovení oxidovaného a redukovaného glutathionu v hemolyzátoru erytrocytů metodou kapilární elektroforézy s UV-VIS detekcí

Abstract

Souhrn V současné době existuje celá řada metod pro stanovení glutathionu v biologickém materiálu. Cílem této práce bylo nalézt vhodnou metodu a optimální podmínky pro separaci a identifikaci redukovaného (GSH) a oxidovaného (GSSG) glutathionu v erytrocytech metodou vysokoúčinné kapilární elektroforézy. Snažili jsme se eliminovat dlouhé preanalytické postupy uváděné v mnoha publikovaných článcích a nalézt optimální a rychlou metodu pro stanovení forem glutathionu. Optimalizovali jsme podmínky, které ovlivňují analýzu GSH a GSSG jako např. pH a koncentrace borátového pufru, průměr a délka kapiláry, napětí, vlnová délka, čas dávkování, teplota a frekvence. Optimalizace byla provedena na dvou různých systémech kapilární elektroforézy se záměrem najít nejvhodnější elektroforeogram pro stanovení glutathionu v hemolyzátech. Nejlepší výsledky jsme získali při použití 300 mmol/l borátového pufru o pH 7,8. K separaci jsme použili křemennou kapiláru o délce 47 cm a průměru 75 µm. Měření probíhalo při napětí 25 kV, proudu 30 µA, teplotě 25řC a vlnové délce 200 nm na kapilární elektroforéze firmy Prince Technologies. Po zavedení pracovních podmínek jsme metodu validovali a použili ji pro stanovení GSH a GSSH v hemolyzátech lidských erytrocytů. Z důvodu dobré a rychlé analytické přípravy může být tato metoda použita pro...

Nowadays exist a lot of methods for setting the glutathione in biological materials. The aim of this work was to develope the right method and optimal conditions for the separation and identification of reduced and oxidized glutathione in red blood cells by capillary electrophoresis. Our biggest effort was to find and eliminate long pre-analytic procedures mentioned in most of the published articles and to find the optimal and fast method for setting forms of glutathione. We optimized conditions which influence the analyze GSH and GSSG for examle: pH and concentration of borate buffer, internal diameter and length of fused-silica capillary, voltage, wavelength, aplying sample under preasure (time dosetion), temperature and frequency. Optimalization has been tryed in two different systems of capillary electrophoresis with the plan to find the most suitable electroforeogram for setting the glutathion in hemolyzate of red blood cells. The best resolution we obtained from using 300 mmol/l borat buffer in pH 7,8. For the separation we used fused-silica capillary in 47 cm lenght and diameter 75 μm. The measurement was passing with voltage 25 kV, current 30 μA, temperature 25o C and the wavelenght 200nm on capillary electrophoresis from company Prince Technologies. We validated the method after...