Characterization of ligand binding to M1 muscarinic acetylcholine receptor using fluorescence anisotropy method

Abstract

Univerzita Karlova Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmakologie a toxikologie Studentka: Hana Danková Školitelé: Prof. Ago Rinken, PhD. MSc. Tõnis Laasfeld PharmDr. Ivan Vokřál, PhD. Téma diplomové práce: Charakterizace vázání ligandů na M1 muskarinový receptor s použitím metody fluorescenční anisotropie Muskarinové acetylcholinové receptory (mAChR), které jsou členy superrodiny receptorů spřažených s G-proteiny, regulují životně důležité fyziologické procesy a jsou významnými cílovými receptory ve výzkumu léčiv. Identifikováno bylo pět subtypů těchto receptorů (M1 - M5). M1 mAChR jsou lokalizovány převážně v centrální nervové soustavě a jsou spojovány s patofyziologií neurodegenerativních onemocnění. V posledních letech byly metody s použitím fluorescence často využívané ve studiích ligandů vážících se na receptory. Fluorescenční anisotropie (FA) je homogenní metoda, která je používána na charakterizaci vázání ligandů na receptory. V této práci jsme vyhodnocovali FA metodu s použitím fluorescenčního ligandu MK342 vázajícího se na M1 mAChR exprimovaný na bakulovirusových částicích. Fluorescenční ligand se vázal s vysokou afinitou (4,4 nM) na M1 receptory exprimované v bakulovirusovém vzorku. Screenovány byly afinity (pKi) jedenácti ortosterických a tří bitopických ligandů, které byly...

Charles University Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Pharmacology and Toxicology Student: Hana Danková Supervisors: Prof. Ago Rinken, PhD. MSc. Tõnis Laasfeld PharmDr. Ivan Vokřál, PhD. Title of diploma thesis: Characetrization of ligand binding to M1 muscarinic receptor using fluorescence anisotropy method Muscarinic acetylcholine receptors (mAChRs), members of the superfamily of G-protein coupled receptors (GPCRs), regulate vital physiological processes and are important targets in drug research. Five different subtypes (M1 - M5) have been identified. M1 mAChR is mainly distributed in the central nervous system and is linked to pathophysiology of neurodegenerative diseases. In recent years, fluorescent methods have been frequently used in studies of ligand binding to receptors. The fluorescence anisotropy (FA) is a homogenous assay to characterize ligand binding to receptors. In this work, we have evaluated the FA method with fluorescent ligand MK342 binding to M1 mAChRs expressed on budded baculovirus (BBV) particles. The fluorescence ligand was binding with the high affinity (4,4 nM) to M1 receptor in constructed BBV preparation. The apparent binding affinities (pKi) of eleven classical and three bitopic muscarinic ligands were screened and compared to previously published...