Analysis of farnesylated peptides and proteins using LC-MS

Abstract

Krátké shrnutí práce Farnesylované proteiny mají velký význam ve vedení signálu buňkou a jako takové mohou hrát roli ve vzniku řady chorob, zejména rakoviny. Hmotnostní spektrometrie s ionizací elektrosprejem je metoda široce využívaná v analýze peptidů a proteinů, proto byla zvolena k vyvinutí snadného způsobu nalezení farnesylovaných proteinů v buňce. Na synteticky farnesylovaných jednoduchých peptidech a hovězím albuminu byl objasněn způsob, jakým se farnesylované peptidy štěpí v hmotnostním spektrometru. Charakteristickým rysem MS/MS spekter těchto peptidů jsou dva píky, které vznikly odštěpením farnesylu od samotného peptidu. Tyto fragmenty se liší v počtu nábojů na fragmentu, to je způsobeno rozdílným druhem štěpení. Rozštěpením vazby mezi sírou cysteinu a farnesylem rovnoměrně, vzniká nový náboj na peptidu a odstupující nabitá skupina o atomové hmotnosti 205. Pokud štěpení probíhá za ztráty neutrálního fragmentu farnesylu, na peptidu zůstává pouze původní náboj a odstupuje fragment o atomové hmotnosti 204, který ztratil jeden atom vodíku ve prospěch peptidu. Tato zjištění lze aplikovat z jednoduchých peptidů i na hledání farnesylace ve vzorcích, obsahující složitou směs proteinů z buněk. Při hledání farnesylovaných proteinů ve vzorku získaném z proteinů buněčné membrány buněk rakoviny prsu, jsem však...

Farnesylated proteins are important in transduction of signals in cell and therefore can figure in development of many diseases, mainly cancer. Electrospray mass spectrometry is a widely used method in analysis of peptides and proteins, thus it was chosen as a method to develop a simple way to detect farnesylated proteins in cell. A cleavage pattern of these proteins, when subjected to MS/MS, was found on examples of synthetically farnesylated simple peptides and bovine albumin. Distinctive features of MS/MS spectra of these peptides are two peaks, which both represent the virgin peptide fragment after the farnesyl moiety was cleaved off. These fragments have a different charge, because they originate from different type of cleavage. Homological cleavage of the bond between the farnesyl and sulfur leads to formation of a new charge on the peptide fragment, while the leaving farnesyl is also charged and has amu of 205. Second type of fragment rises from neutral loss of farnesyl moiety, there is no new charge generated on the peptide fragment and the amu of the leaving farnesyl moiety is 204, because it looses one of its hydrogen in favor of the peptide. This knowledge can be applied also to more complicated protein samples prepared from cells. When searching for farnesylated proteins in such a...