Využití geneticky modifikovaných buněčných linií ke studiu transportních procesů v ledvinných in vitro modelech.

Abstract

Charles University Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Pharmacology and Toxicology Student: Michaela Mužíková Supervisor: PharmDr. Lucie Smutná, PhD. Title of diploma thesis: Using of genetically modified cells lines to study transport processes in in vitro kidney models Transport processes in renal cells are mostly secured by proximal tubule transporters. These transporters mediate excretion and reabsorption of wide variety of endogenous and exogenous substances, including xenobiotics. Within the broad spectrum of many drug-transporting proteins, we have chosen the glycoprotein megalin (LRP2), a receptor involved in the reabsorption of albumin and other endogenous substances, such as insulin or hemoglobin. Peptide and aminoglycoside antibiotics represented by e.g., gentamicin and belongs between LRP2 ligands. The diploma thesis deals with the development and utilization of the LRP2 knockout cell lines in accumulation studies. The experiments were performed using human cell lines naturally expressing LRP2, the JEG-3 and HK-2. Several genetically modified cell lines expressing unfunctional LRP2 and consequently exerting harmed ability of model ligand internalization were prepared using the CRISPR/Cas9 technique. The effect was confirmed by accumulation studies with FITC-albumin....

Univerzita Karlova Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmakologie a toxikologie Studentka: Michaela Mužíková Školitelka: PharmDr. Lucie Smutná, Ph.D. Název diplomové práce: Využití geneticky modifikovaných buněčných linií ke studiu transportních procesů v ledvinných in vitro modelech Transportní procesy v ledvinných buňkách z velké části zajišťují transportéry proximálních tubulů umožňující exkreci a reabsorpci různých endogenních i exogenních látek včetně xenobiotik. Z velkého množství transportních proteinů jsme pro studium zvolili glykoprotein megalin (LRP2), receptor účastnící se reabsorpce albuminu a dalších tělu vlastních látek, např. inzulinu nebo hemoglobinu. Mezi ligandy LRP2 z řad xenobiotik řadíme peptidová a aminoglykosidová antibiotika, zastoupená např. gentamicinem. Diplomová práce se zabývá vývojem a využitím LRP2 knockoutovaných buněčných linií v akumulačních studiích. Experimenty jsme prováděli na liniích přirozeně exprimujících LRP2, JEG-3 a HK-2. S využitím metody CRISPR/Cas9 bylo připraveno několik geneticky modifikovaných buněčných linií s nefunkčním LRP2 receptorem, a tedy i s narušenou schopností endocytovat modelové ligandy (jako je albumin nebo gentamicin), což potvrdily akumulační studie s užitím FITC-albuminu. Akumulace FITC-albuminu u modifikovaných linií...