Vývoj HPLC metody pro monitorování přípravy oligodeoxynukleotidových sond

Abstract

Univerzita Karlova Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmaceutické chemie a farmaceutické analýzy Kandidát: Mgr. Tomáš Šemlej Vedoucí rigorózní práce: doc. PharmDr. Radim Kučera, Ph.D. Název rigorózní práce: Vývoj HPLC metody pro monitorování přípravy oligodeoxynukleotidových sond Uměle připravená oligodeoxynukleotidová sekvence s navázanou značkou je označována jako molekulární sonda. Molekulární sondy se uplatňují především ke kvantifikaci multiplikace při RT-PCR a identifikaci mutací při PCR analýzách. Typicky existují dva druhy molekulárních sond - jednoduše značené molekulární sondy a dvojitě značené molekulární sondy. Jednoduše značené molekulární sondy obsahují oligodeoxynukleotidovou sekvenci s navázaným fluoroforem nebo zhášečem. Zatímco dvojitě značené molekulární sondy se skládají z oligodeoxynukleotidové sekvence s navázaným fluoroforem na jednom konci a se zhášečem navázaným na druhém konci řetězce. V této práci jsme nejprve věnovali pozornost separaci dvojitě značených oligodeoxynukleotidů od jednoduše značených oligodeoxynukleotidů. Byly testovány různé typy stacionárních fází a pro separaci směsi značených oligodeoxynukleotidů byla vybrána kolona Clarity® Oligo-RP™, která byla selektivní ke všem testovaným standardům. V další části jsme se zaměřili na monitorování...

Charles University Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Pharmaceutical Chemistry and Pharmaceutical Analysis Candidate: Mgr. Tomáš Šemlej Supervisor: doc. PharmDr. Radim Kučera, Ph.D. Title of rigorosum thesis: The development of an HPLC method for monitoring the preparation of oligodeoxynucleotide probes An artificially prepared oligodeoxynucleotide sequence with the attached label is referred to as a molecular probe. Molecular probes are mainly used to quantify multiplication in RT-PCR and identify mutations in PCR analyses. There are typically two different types of probes - mono-labeled molecular probes and double-labeled molecular probes. The mono-labeled molecular probes are constructed from fluorophore- labeled oligodeoxynucleotide sequence or quencher-labeled oligodeoxynucleotide sequence. Whereas double-labeled molecular probes consist of an oligodeoxynucleotide sequence with a fluorophore attached at one end together with a quencher attached at the other end of the chain. In this work, we first paid attention to the separation of double- labeled oligodeoxynucleotides from mono-labeled oligodeoxynucleotides. Several types of stationary phases were tested and based on that the column Clarity® Oligo-RP™ was chosen to separate a mixture of labeled oligodeoxynucleotides. This...