Klonování a příprava plasmidu pro expresi reduktázy z vlasovky slezové

Abstract

Charles University Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Biochemical Sciences Candidate: David Klouček Supervisor: doc. Ing. Petra Matoušková, Ph.D. Title of diploma thesis: Plasmid constuction for expression of reductase from Haemonchus contortus Haemonchus contortus is the most important pathogenic nematode of small ruminants, mostly sheep and goats. It causes haemonchosis leading to massive deaths of infected animals. Pharmacotherapy by approved anthelmintics is the main solution to the disease. Currently, the growing resistance to available antihelmintics is still bigger and bigger problem, leading to economical and ecological issues. There are many causes of resistance. Among the non-target site mechanisms of resistance belongs the increased activity of enzymes from the first biotransformation phase mediating carbonyl-reduction; specifically aldo/ketoreductases and dehydrogenases/reductases. Increased activity of these enzymes leads to faster drug metabolism, formation of inactive metabolites and therapy failure. The aim of the thesis was to prepare a plasmid for the expression of selected reductase, which can be used for further study of the activity and possibly design of new targeted drugs. Method, which were used during my experimental work, involved isolation of RNA, reverse...

Univerzita Karlova Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: David Klouček Vedoucí: doc. Ing. Petra Matoušková, Ph.D. Název diplomové práce: Klonování a příprava plasmidu pro expresi reduktázy z vlasovky slezové Vlasovka slezová (Haemonchus contortus) je nejvýznamnější patogenní hlístice malých přežvýkavců, zejména ovcí a koz. Způsobuje haemonchózu, v důsledku čehož dochází k masivnímu úhynu nakažených zvířat. Hlavním řešením nákazy je farmakoterapie schválenými anthelmintiky. V současnosti je stále se zvětšujícím problémem narůstající rezistence vlasovky vůči dostupným anthelmintikům, což vede k dopadům ekologickým, tak ekonomickým. Příčin rezistence vlasovky je několik. Mezi mechanismy rezistence, jiné než v cílové molekule anthelmintika, lze zařadit zvýšenou aktivitu enzymů 1. fáze biotransformace zprostředkovanou karbonyl-redukujícími enzymy. Konkrétně aldoketoreduktázy a dehydrogenázy/reduktázy. Zvýšená aktivita těchto enzymů vede k rychlejšímu metabolismu léčiv, vzniku neúčinných metabolitů a selhání léčby. Cílem diplomové práce byla příprava plasmidu pro expresi vybrané reduktázy, který může být využit pro další studování aktivity a případně tvorbu nových cílených léčiv. Metody použité v experimentální části byly izolace RNA, reverzní transkripce, PCR,...