Regenerative Medicine in Ocular Surface Reconstruction: Advancing Cell-Based Therapies for Limbal Stem Cell Deficiency

Abstract

Limbal stem cell deficiency is a disease caused by the impairment of limbal epithelial stem cells (LESCs), leading to the replacement of the corneal surface with nontransparent conjunctiva, and its treatment is not standardly available worldwide. This work focuses on preparing cells for treating both uni- and bilateral forms of the disease using advanced cell- based therapy. It investigates LESCs in various scaffolds (fibrin, nanofibers) and explores non-limbal cell sources like oral mucosal epithelial cells (OMECs) under standard complex and xenobiotic-free culture conditions. The study uses immunofluorescence and gene expression to detect stem cell markers, proliferation, and differentiation capacity of cultured cells. Moreover, long-term OMECs storage with different media and cryoprotective agents and the healing properties of the amniotic membrane (AM) were also examined. We found that adding interleukin-13 to the culture media enhanced LESCs' stemness. LESCs on fibrin gels showed higher expression of stemness markers, while those on polymers expressed more mesenchymal ones. Using standard and xeno-free media, we successfully prepared OMEC-containing cell sheets on fibrin gel substrates. The cultured cells exhibited high expression of stemness genes (ΔNp63α, NGFR, KLF4) and decreased levels of...

Deficience limbálních kmenových buněk je onemocnění způsobené poškozením limbálních epiteliálních kmenových buněk (LESC), které vede k přerůstání průhledné rohovky netransparentní spojivkou a ztrátě zraku. Léčba není standardně dostupná. Tato práce se věnuje přípravě buněk pro léčbu jedno- i oboustranné formy deficience pomocí moderní buněčné terapie. Zkoumá růst LESC na různých substrátech (fibrin, nanovlákna), dále buňky epitelu bukální sliznice (OMEC), kultivované ve standardním komplexním médiu i v podmínkách bez xenobiotik. K detekci markerů kmenových buněk, stanovení proliferační a diferenciační kapacity kultivovaných buněk byla použita imunocytochemie a genová exprese. Kromě toho byl hodnocen vliv dlouhodobého skladování OMEC v médiích s různými kryoprotektivními látkami. Součástí teze bylo i hodnocení hojivých vlastností amniové membrány (AM). Zjistili jsme, že přidání interleukinu-13 do kultivačního média zvýšilo kmenovost LESC. LESC pěstované na fibrinu více exprimovaly márkry kmenovosti, buňky na nano- vlákenných polymerech exprimovaly více márkrů mezenchymálních. Na fibrinu se nám kultivací ve standardním komplexním médiu, ale i v prostředí bez cizorodých látek (xeno- free) podařilo připravit kultury OMEC. Buňky vykazovaly vysokou expresi kmenových márkrů (ΔNp63α, NGFR, KLF4) a sníženou...