Izolácia exozómov produkovaných makrofágmi infikovaných F. tularensis

Abstract

Charles University Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Biological and Medical Sciences Author: Michaela Hudáková Supervisor: RNDr. Klára Konečná, Ph.D. Consultant: doc. PharmDr. Ivona Pávková, Ph.D. Title of master's thesis: Isolation of exosomes produced by macrophages infected with F. tularensis Background: The main objective of the presented work was to establish and optimize a model for isolating exosomes from infected BALB/c mouse macrophages using the virulent strain of the bacterium Francisella tularensis subsp. holarctica FSC200, followed by the basic characterization and identification of the isolated proteins. Methods: The model setup for the exosome isolation method was carried out using light and fluorescence microscopy, during which the experimental conditions were established - a two-hour interval for infection, and cultivation and infection of cells in a serum-free environment. For the actual isolation of exosomes, a method based on differential centrifugation and ultracentrifugation was chosen. Selected analytical methods were used for the basic characterization of the isolated proteins - protein determination using bicinchoninic acid modified for small volumes and and analysis by dynamic light scattering. The final identification of these proteins was carried out by...

Univerzita Karlova Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biologických a lekárskych vied Autor: Michaela Hudáková Vedúci diplomovej práce: RNDr. Klára Konečná, Ph.D. Konzultant: doc. PharmDr. Ivona Pávková, Ph.D. Názov diplomovej práce: Izolácia exozómov produkovaných makrofágmi infikovaných F. tularensis Cieľ práce: Hlavným cieľom predkladanej práce bolo nastavenie a optimalizácia modelu izolácie exozómov z infikovaných makrofágov izolovaných z myší typu BALB/c, virulentným kmeňom baktérie, Francisella tularensis subsp. holarctica FSC200 s následnou základnou charakterizáciou a identifikáciou vyizolovaných proteínov , ktoré sa typicky vyskytujú v štruktúre a obsahu exozómov. Metódy: Nastavenie modelu pre metódu izolácie exozómov prebehlo za využitia svetelnej a fluorescenčnej mikroskopie, kedy boli stanovené podmienky experimentu - dvojhodinový interval k infekcii, kultivácia a infekcia buniek v prostredí bez obsahu séra. Pre samotnú izoláciu exozómov bol zvolený postup založený na použití diferenciálnej centrifugácie a ultracentrifugácie. K základnej charakteristike vyizolovaných exozomálnych proteínov boli využité zvolené analytické metódy - stanovenie bielkoviny pomocou kyseliny bicinchonínovej modifikované pre malé objemy a analýza pomocou dynamického rozptylu svetla. Výsledná...