Antimikrobiální peptidy při infekcích gramnegativními bakteriemi

Abstract

Bc. Petra Tocháčková Antimikrobiální peptidy při infekcích gramnegativními bakteriemi Diplomová práce - abstrakt Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Farmacie Cíl práce: Cílem práce je vypracování metodiky a stanovení možné genové aktivace antimikrobiálních peptidů (beta defensinů 1 a 2 - pBD1 a pBD2) v ileu při infekci gnotobiotických selat gramnegativními bakteriemi. Jako zástupce gramnegativních bakterií různé virulence byla zvolena Salmonela enterica serovar Typhimurium, kmen LT2 a její R mutanty (rfaG- a rfaL-). Metody: 1) Návrh systémů pro stanovení prasečích pBD1 a pBD2 (software), 2) Purifikace celkové RNA (komerční kolony), kvantifikace (spektrofotometricky) a odhad její čistoty (poměr A280/A260), 3) Reverzní transkripce (směs náhodných n- merů a oligo d(T)m), 4) Kvantifikace cDNA (polymerázová řetězová reakce v reálném - LNA sondy) a 5) Normalizace genového přepisu pro pBD1 a pBD2 vůči beta aktinu, cyklofilinu A nebo oběma kontrolním genům zároveň. Výsledky: Pro purifikaci celkové RNA a syntézu cDNA jsme použili metody, které snižují riziko kontaminace genomovou DNA a tím i falešně pozitivních výsledků. Navrhli jsme detekční systémy pro stanovení pBD1 a pBD2, jejichž efektivita byla okolo 100% (srovnatelná s efektivitami systémů pro kontrolní geny). Transkripce pBD1...

Bc. Petra Tocháčková Antimicrobial peptides in infections with grammnegative bacteria Diploma thesis - abstract Charles University in Prague, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Pharmacy Background: Aim of this thesis was a development of methods for detection of gene activation of antimicrobial peptides (beta defensins 1 and 2 - pBD1 and pBD2) in ileum during infection of gnotobiotic piglets with gramnegative bacteria. Salmonella enterica serovar Typhimurium strain LT2 and its R mutants (rfaG- and rfaL-) were selected as representants of gramnegative bacteria of different virulence. Methods: 1) Suggestion of systems for detection of pBD1 and pBD2 (software), 2) Purification of total RNA (commercial columns), quantification (spectrophotometry), and estimation of its purity (ratio A280/A260), 3) Reverse transcription (mixture of random n-mers and oligo d(T)m), 4) Quantification of cDNA (real time polymerase chain reaction - LNA probes), and 5) Normalization of gene transcription for pBD1 and pBD2 against beta actin, cyclophilin A or to both together. Results: We used a method reducing risk of contamination by genomic DNA and obtaining of false positive results for purification of total RNA. We suggested detection systems for estimation of pBD1 and pBD1 with efficiency approx. 100% (comparable with...