Stanovení vitamínu C a dehydroaskorbové kyseliny s využitím metody UPLC-MS

Abstract

Spojení ultra vysoko účinné kapalinové chromatografie s detekcí pomocí hmotnostního spektrometru (UHPLC-MS) poskytuje metodu, která je velice rychlá a citlivá. Tato diplomová práce byla zaměřena na využití UHPLC-MS ke stanovení kyseliny askorbové (AA) a dehydroaskorbové (DHA). AA je malá polární molekula, která působí jako antioxidant. Oxidací AA vzniká DHA. Poměr AA a DHA je ukazatelem redoxního stavu organismu. Pro stanovení AA a DHA již bylo vyvinuto několik metod, které však většinou neumožňují současné stanovení, ale vyžadují vícekrokový postup subtrakce. Optimalizace UHPLC-MS metody pro stanovení AA a DHA zahrnuje volbu mobilní a stacionární fáze a nastavení hmotnostního detektoru. Volba vhodných podmínek závisela především na retenčním čase a odezvě detektoru. Byl sledován vliv stacionární fáze a dále koncentrace, pH a složení mobilní fáze na retenci AA a DHA. Byl sledován i vliv mobilní fáze na stabilitu AA a DHA. Porovnávanými stacionárními fázemi byly kolona BEH Shield RP C18, BEH HILIC a BEH Amide kolona. Nejlepších výsledků bylo dosaženo na koloně BEH Shield RP C18. Pro zjištění vhodné mobilní fáze byla provedena měření s 0,1%, 0,05%, 0,01% kyselinou mravenčí, 0,1%, 0,05%, 0,01% kyselinou octovou, mravenčanem amonným o pH 3,5 a octanem amonným o pH 4,4 a 6,8 jako vodnou složkou. Nakonec...

A coupling of Ultra High Performance liquid chromatography with mass spectrometry provides a technique, which is rapid and sensitive. This thesis is focused on the use of UHPLC-MS for the determination of ascorbic acid (AA) and dehydroascorbic acid (DHA). AA is a small polar molecule that acts as an antioxidant. After oxidation AA creates DHA. AA/DHA ratio is an indicator of a redox state of organism. For the determination of AA and DHA several methods have been developed, which usually do not allow the simultaneous analysis, but require multistep subtraction procedure. The optimization of UHPLC-MS method for the determination of AA and DHA include the choice of mobile and stationary phase and mass spectrometry detector set- up. The choice of appropriate conditions depended mainly on retention time and the detector response. The effect of stationary phase, concentration, pH, composition of mobile phase on retention of AA and DHA was observed. Effect of mobile phase on stability of AA and DHA was observed as well. BEH Shield RP C18, BEH HILIC and BEH Amide column were compared. The best results were achieved on column BEH Shield RP C18. Measurements with 0.1%, 0.05%, 0.01% formic acid, 0.1%, 0.05%, 0.01% acetic acid, ammonium formate at pH 3.5 and amonium acetate at pH 4.4 and 6.8 as a water...