Komplementace dsbA mutantního kmene Francisella tularensis a analýza potenciálních vazebných partnerů proteinu DsbA

Abstract

Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Bc. Iva Šenitková Školitel: doc. PharmDr. Tomáš Šimůnek, Ph.D. Školitel - konzultant: RNDr. Petra Špidlová, Ph.D. Název diplomové práce: Komplementace dsbA mutantního kmene Francisella tularensis a analýza potenciálních vazebných partnerů proteinu DsbA Konzervovaný hypotetický lipoprotein FTT1103 je virulenčním faktorem gramnegativní intracelulární bakterie F. tularensis. Tento protein je homologní k proteinům disulfid oxidoreduktázové rodiny DsbA. Proteiny této rodiny katalyzují tvorbu disulfidických vazeb, které jsou nezbytné pro utvoření správné konformace proteinů, pro jejich aktivitu a stabilitu. Cílem práce byla identifikace vazebných partnerů lipoproteinu FTT1103 běžně nazývaného DsbA, jejichž znalost by nám mohla pomoci v hlubším pochopení role lipoproteinu DsbA ve virulenci F. tularensis. Pomocí metod molekulární biologie jsme vytvořili fúzní gen ftt1103 se sekvencí kódující FLAG® kotvu a klonovali ho do plazmidového vektoru replikujícího se ve F. tularensis. Plazmidový vektor jsme elektroporací vnesli do in frame delečního mutanta F. tularensis subsp. holarctica kmen FSC200/∆1103, čímž došlo k jeho komplementaci in trans. Protein DsbA obsahující FLAG® epitop jsme spolu s jeho...

Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Biochemical Science Candidate: Bc. Iva Šenitková Supervisor: doc. PharmDr. Tomáš Šimůnek, Ph.D. Supervisor - consultant: RNDr. Petra Špidlová, Ph.D. Title of diploma thesis: Complementation of Francisella tularensis dsbA mutant strain and analysis of potential binding partners of DsbA protein Conserved hypothetical lipoprotein FTT1103 is a virulence factor of gram- negative intracellular bacterium F. tularensis. This protein shares homology with proteins of disulfide oxidoreductase DsbA family. These proteins catalyse formation of disulfide bonds, which are essential for forming proteins conformation, for activity and stability of proteins. The aim of this study was to identify binding partners of lipoprotein FTT1103, commonly known as DsbA. The knowledge of these partners could help us in understanding a role of lipoprotein DsbA in virulence F. tularensis. We prepared fused ftt1103 gene with sequence coding FLAG® tag and cloned this fused gene into plasmid vector which can be replicated in F. tularensis. We used electroporation for introducing plasmid vector into the in frame deletion mutant F. tularensis subsp. holarctica strain FSC200/∆1103 thereby we complemented this deletion mutant in trans. Imunoprecipitation by...