Příprava rekombinantní cDNA některých lékových transportérů

Abstract

Pro následnou přípravu buněčné linie se zvýšenou expresí transportéru MRP3 byl připraven vhodný plazmid obsahující kódující sekvenci pro tento transportér. Experimentálně bylo stanoveno složení reakční směsi a teplotní profil PCR pro amplifikaci sekvence kódující transportér MRP3. Připojením adenosinu byl PCR produkt upraven pro klonování do plazmidu pCR® -XL-TOPO® . Plazmid pCR® -XL-TOPO® se zaklonovanou sekvencí a plazmid pZeoSV2(-) byly štěpeny restrikčními endonukleázami EcoRV a SpeI. Následně bylo možné díky komplementárním koncům vyštěpenou kódující sekvenci MRP3 zaklonovat do plazmidu pZeoSV2(-), který je vhodný pro transfekci eukaryotní buněčné linie. Klonování bylo úspěšné.

We have prepared suitable plasmid containing coding sequence of MRP3, for subsequent preparation of cell line overexpressing this transporter. Composition of reaction mixture and temperature profile of PCR reaction for MRP3 coding sequence amplification was determined experimentally. Adenosine was added to 3' ends of PCR product to allow cloning into PCR® -XL-TOPO® vector. pCR® -XL-TOPO® vector containing cloned sequence and pZeoSV2(-) plasmid were cleaved using restriction endonucleases EcoRV and SpeI. Afterwards it was possible to clone cleaved coding sequence into pZeoSV2(-) plasmid due to complementary ends. Prepared plasmid is suitable for transfection of eukaryotic cell lines. The cloning was successful.