Klonování, charakterisace a exprese mutantů lidské serinracemasy

Abstract

AAbbssttrraakktt Lidská serinracemasa (hSR) je cytosolický enzym využívající pyridoxal-5'-fosfát, který je lokalizován v centrální nervové soustavě. Syntetizuje D-serin, aminokyselinu, jež je endogenním koagonistou N-methyl-D-aspartátových (NMDA) receptorů a hraje tak v mozku klíčovou roli v excitační neurotransmisi. Lidská serinracemasa je tudíž slibným cílem při léčbě neurodegenerativních onemocněních spojených s NMDA receptory. Zatím však bylo identifikováno jen málo specifických inhibitorů a krystalová struktura hSR byla vyřešena teprve nedávno. Rozhodli jsme se tedy pomocí náhodné mutageneze určit aminokyselinové zbytky klíčové pro aktivitu enzymu. O zbytku Ser 84 je známé, že se spolu s Lys 56 podílí na katalýze. Poté, co jsme analyzovali mutanta S84G/P111L lidské serinracemasy, který si zachovával schopnost konvertovat L-serin na pyruvát, jsme syntetizovali a charakterizovali mutantní hSR S84G, abychom mohli vyloučit případný vliv mutace P111L. KKllííččoovváá sslloovvaa:: D-serin; Serinracemasa; Enzymy závislé na PLP; Mutageneze; Racemasy

AAbbssttrraacctt Human serine racemase (hSR) is a cytosolic pyridoxal-5'-phosphate dependent enzyme localized in the central nervous system. It synthesizes D-serine, which is an endogenous coagonist for the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors and plays a key role in excitatory neurotransmission in the brain. Thus, human serine racemase is a promising target for the treatment of neurodegenerative diseases connected with NMDA receptors. However, few specific inhibitors have been identified to date and the crystal structure of hSR has become available only very recently. We decided to perform a random mutagenesis to determine the amino acid residues critical for the enzyme activity. Ser 84 was reported as a catalytic residue along with Lys 56. After analysis of a double mutant S84G/P111L which retained its capability to convert L-serine to pyruvate, we prepared and characterized the single mutant S84G in order to exclude potential effect of the P111L mutation.on the activity of the analyzed enzyme. KKeeyy wwoorrddss:: D-serine; Serine racemase; PLP-dependent enzymes; Random mutagenesis; Racemases