Porovnání extrakčních postupů ze séra pro HPLC stanovení liposolubilních vitamínů

Abstract

Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra analytické chemie Kandidát: Bc. Lenka Nápravníková Konzultant: Prof. RNDr. Petr Solich, CSc. Konzultant specialista: Doc. RNDr. Dagmar Solichová, Ph.D. Název diplomové práce: Porovnání extrakčních postupů ze séra pro HPLC stanovení liposolubilních vitamínů V diplomové práci byly porovnány metody extrakce na pevnou fázi (SPE) a extrakce z kapaliny do kapaliny (LLE) použité pro separaci vitamínů rozpustných v tucích: A (retinol), E (α-tokoferol), D2 (ergokalciferol), D3 (cholekalciferol), 25- (OH)D3 (kalcidiol) z lidského séra. Vitaminy byly následně stanoveny vysoce účinnou kapalinovou chromatografií (HPLC). Jako výchozí metoda byl použit postup, který byl vyvinut a částečně zvalidován v rámci diplomové práce: Aplikace SPE a technologie monolitních kolon v HPLC analýze biologicky aktivních látek (Horčičková 2009). Tento postup byl dále optimalizován za účelem navýšení výtěžnosti extrakce pro cílové analyty 25(OH)D3, D2 a D3 a zkrácení preanalytické fáze. Byly testovány podmínky: objem vzorku, deproteinace séra (činidla, objem, teplota, čas), kondicionace SPE kolonek (promývání vodou, dávkování), různé SPE kolonky, postup eluce (činidla, dávkování, použití vakua), vliv centrifugace na čistotu extraktu, využití Eppendorf a...

Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Analytical Chemistry Candidate: Bc. Lenka Nápravníková Consultant: Prof. RNDr. Petr Solich, CSc. Consultant Specialist: Doc. RNDr. Dagmar Solichová, Ph.D. Diploma Thesis Title: Comparison of extraction procedures for HPLC determination of liposolubile vitamines in serum In this thesis were compared extraction methods, solid phase extraction (SPE) and liquid liquid extraction (LLE) used for separation of human serum fat soluble vitamins: A (retinol), E (α-tocopherol), D2 (ergocalcipherol), D3 (cholecalcipherol), 25- (OH)D3 (calcidiol). Vitamins were then determinated by high performace liquid chromatography (HPLC). As a baseline method used the procedure that was developed and partially validated the thesis: Application of the SPE technology and monolithic columns in HPLC analysis of biologically active substances (Horčičková 2009). This procedure was further optimized in order to increase the extraction of target analytes 25(OH)D3, D2 and D3 and shortening the preanalytical phase. Conditions were tested: sample volume, deproteination of serum (reagents, volume, temperature, time), the conditioning of SPE columns (water washing, the dosage), various SPE columns, elution process (agent, the dosage, use of vacuum), the...