Optimalizace purifikace lidské membránově vázané karbonylreduktasy

Abstract

Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Rudolf Andrýs Vedoucí práce: prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. Název diplomové práce: Optimalizace purifikace lidské membránově vázané karbonylreduktasy Enzymy redukující karbonylové skupiny se účastní metabolismu mnohých endogenních i exogenních látek. Většina dosud popsaných enzymů účastnících se metabolismu xenobiotik je cytosolických, jediným takovým zatím známým mikrosomálním enzymem je 11β-hydroxysteroiddehydrogenasa 1 (11β-HSD1). Podílí se také na metabolismu oracinu, prochirálního protinádorového léčiva, které je redukováno na (+) a (-) 11-dihydrooracin (DHO). Na základě rozdílů stereospecifit mezi lidskou mikrosomální frakcí a 11β-HSD1 se předpokládá podíl dalšího mikrosomálního enzymu na biotransformaci oracinu. Cílem této práce je potvrzení přítomnosti a purifikace tohoto nového lidského mikrosomálního enzymu. Lidské jaterní mikrosomy byly solubilizovány a odsoleny. Jako první purifikační krok byla využita Q-sepharosa. Vybraná frakce Q2, získaná touto metodou, byla podrobena druhému purifikačnímu kroku na Phenyl-sepharose. Jedna ze získaných frakcí splňující požadavky byla dále přečištěna gelovou filtrací. Ve všech frakcích získaných během purifikace byla stanovena redukční aktivita vůči...

Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Biochemical Sciences Candidate: Rudolf Andrýs Supervisor: prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D Title of diploma thesis: Optimalization of purification of a human membrane-bound carbonyl reductase Carbonyl reductases are enzymes participating in metabolic pathways of various eobiotics and xenobiotics. Of all known enzymes metabolizing xenobiotics only 11β-hydroxysteroid dehydrogenase 1 (11β-HSD1) is found in the microsomal membrane. It also contributes to metabolism of prochiral anticancer drug oracin, which main metabolic pathway is a carbonyl reduction on the position 11 leading to two enantiomers of (+) an (-) 11-dihydrooracin (DHO). Based on the discrepancy between microsomes and 11β-HSD1 stereospecifity of oracin reduction exist a hypothesis of participation an unknown microsomal enzyme in oracin metabolism. The aim of this study is to purify a new microsomal carbonyl reducing enzyme contributing in the biotransformation of oracin. Human liver microsomes were solubilised and desalted. The prepared sample was used for the first purification step on Q-Sepharose. Captured flow through fraction Q2 was loaded on Phenyl-sepharose. Captured suitable fraction P11 was used for third purification step by gel filtration. All...