Preparation of cDNA of selected gene and cloning.

Abstract

Abstrakt ABC jsou velká skupina transmembránových proteinů, o kterých je známo že hrají klíčovou roli v rozvoji lékové rezistence. Schopnost těchto proteinů aktivně transportovat širokou škálu látek ven z buňky je hlavním principem - schopnosti řady nádorových buněk odolávat působení chemoterapeutik. Pro studium aktivity lékových transportérů a jejich substrátů či inhibitorů bylo vyvinuto množství in vitro modelů. Tyto modely jsou založeny na využití savčích buněk, které jsou geneticky manipulovány tak, aby v plazmatické membráně exprimovaly vybraný efluxní transportér. Pro genetické modifikace těchto buněk se využívá řada produkčních plazmidů. V naší práci jsme se zaměřili na vývoj univerzálního produkčního plazmidu obsahujícího krátkou V5 tag sekvenci a umožňujícího následné vklonování kódující sekvence vybraného lékového transportéru tak, aby byl V5 tag lokalizován na jeho 3' konci. Výsledný produkční plazmid tak může být dále použit k transfekci vhodné savčí buněčné linie, která bude sloužit jako model pro studium aktivity efluxního transportéru in vitro. Vybraný transportér je v buněčné linii produkován jako fúzní protein s V5 tagem lokalizovaným na jeho C-konci. Tak může tento tag sloužit jako univerzální marker proteinové exprese detekovatelný s pomocí imunohistochemických metod. Pro konstrukci V5...

ABC drug efflux transporters are transmembrane proteins which are known to play a crucial role in drug resistance. The ability of these proteins to actively transport a wide variety of compounds out of the cell is one of the key reasons behind the resistance of cancer cells to chemotherapeutic agents. To study the activity of efflux transporters and identify their substrates or inhibitors a number of in vitro models have been developed. These models are based on the mammalian cells genetically modified in order to express the protein of interest. For genetic manipulations of the cells various expression plasmids are used. In our study we attempted to prepare a universal expression plasmid, containing a short sequence of V5 tag. Such plasmid enables further cloning of coding sequences of selected efflux transporters so that the V5 tag is localized on their 3'-end. Once constructed, the plasmid can further be used to transfect the desired cell line, thus developing an in vitro cell model. Since the transporter is produced as a fusion protein with the V5 tag localized on their C-end, the tag could be used as a universal marker of the transporter expression detectable by immunohistochemical methods. To construct the V5 tag sequence two approaches were employed both leading to the product of the desired...