Návrh Real-Time PCR testu pro detekci Aphibiocystidium ranae jako modelového druhu pro studium rhinosporidiózy

Abstract

Cílem této diplomové práce je návrh testu na druhově specifické Real-Time PCR pro detekci parazita Ampbibiocystidium ranae u žab, který slouží jako modelový druh pro studium rhinosporidiozy u člověka, způsobené Rhinosporidiem seeberi. Společné vlastnosti těchto parazitů umožňuji zkoumat rhinosporidiozu pomocí vzajemné analogie. Sekvence genu pro 18S rRNA Amphibiocystidium ranae byly porovnány se sekvencemi nejbližších příbuzných organismů nalezených v GenBank databázi nukleotidových sekvenci pomoci mnohočetného přiřazeni. Byly vyhledány úseky specifické pro Amphibiocystidium ranae a v těchto úsecích byly navrženy tři sady příměrů, z toho dvě spolu se sondou pro zvýšení specificity. Navržena assay byla ověřena oproti GenBank databázi nukleotidových sekvenci a oproti databázi SILVA, která obsahuje sekvence kódující rRNA. Primery byly otestovány na vzorcích odebraných z žab. Výsledné produkty byly ověřeny analýzou křivky tání. Výsledkem je Real-Time PCR assay, kterou lze použit ke specifické detekci přítomnosti Amphibiocystidium ranae.

The aim of this thesis is to develop species-specific Real-Time PCR assay for detection of frog parasite Amphibiocystidium ranae as a model approach for studying rhinosporidiosis in human, caused by Rhinosporidium seeberi. Similarities of these parasites allow to study human rhinosporidiosis by analogy. Sequences of the gene for 18S rRNA of Amphibiocystidium ranae were analysed by multiple sequence alignment with sequences of closely related organisms found in GenBank nucleotide database. Amphibiocystidium ranae-specific regions were found and three primer sets were designed, two of them together with probe to increase specificity. Specificity was checked against GenBank nucleotide database and ribosomal RNA database SILVA. Primer sets were tested on samples taken from frogs. Specificity was confirmed by melting curve analysis. Amphibiocystidium ranae-specific Real-Time PCR assay was developed and can be used for detection of this parasite.