Klonování, exprese a purifikace lidské 17beta-HSD1

Abstract

Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Řešitel: Bc. Lenka Popovská Školitel: Prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. Název diplomové práce: Klonování, exprese a purifikace lidské 17β-HSD1 17β-hydroxysteroiddehydrogenasa typu 1 (17β-HSD1; SDR28C1; EC 1.1.1.62) patřící do nadrodiny SDR katalyzuje NAD(P)(H) dependentní oxidoredukci oxo/β-hydroxylové skupiny na sedmnáctém uhlíku androgenních a estrogenních hormonů. Tento reversibilní konverzní přesmyk mezi 17β-OH receptorovým ligandem a jeho 17-oxo inaktivním metabolitem představuje důležitý prereceptorový kontrolní mechanismus jaderných receptorových ligandů. Estradiol je nejúčinnější ženský pohlavní steroidní hormon a jako jediný je zodpovědný za účinky estrogenů u žen. Primárním zdrojem estradiolu přítomného v oběhu u žen před menopauzou jsou vaječníky, cirkulující estron a androgeny pocházející z nadledvin jsou v periferních tkáních (jako např. v tkáni tukové) také přeměněny na estradiol, a to díky enzymu 17β-HSD1. U žen v menopauze je hlavním zdrojem estrogenů periferní tkáň, kde dochází k jejich biosyntéze. Pro přípravu rekombinantního proteinu 17β-HSD1 byly použity bakterie E. coli DH10B s vloženým plasmidem pOTB7, který obsahoval kódovou sekvenci žádaného enzymu. Daná sekvence byla z plasmidu...

Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Biochemical Sciences Candidate: Bc. Lenka Popovská Supervisor: Prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. Title of diploma thesis: Cloning, expression and purification of human 17β-HSD1 17β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 (17β-HSD1; SDR28C1; EC 1.1.1.62) belongs to the SDR superfamily and catalyzes the NAD(P)(H) dependent oxidoreduction of hydroxyl/keto groups at position C17 of androgens and estrogens and in this manner regulate intracellular availability of steroid hormone ligands to their nuclear receptors. This pathway constitutes a pre-receptor control mechanism. Estradiol is the most potent female sex steroid and the only one responsible for estrogen action in women. The ovary is the primary source of estradiol present in the circulation of premenopausal women, but circulating estrone and androgens originating from the adrenal gland are also converted to estradiol in peripheral tissues such as adipose tissue. After menopause, estrogen biosynthesis in peripheral tissues has a major role in estrogen action. For production of recombinant protein 17β-HSD1 bacterial strain E. coli DH10B with inserted vector pOTB7, which contained coding sequence of the respective enzyme, was used. The sequence of the enzyme was isolated from...