Klonování, exprese a purifikace disulfid oxidoreduktázy Francisella tularensis

Abstract

Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Bc. Michaela Kohlová Školitel: doc. PharmDr. Tomáš Šimůnek Školitel-konzultant: Mgr. Monika Schmidt Název diplomové práce: Konstrukce, exprese a purifikace disulfid oxidoreduktázy Francisella tularensis Konzervovaný hypotetický lipoprotein s označením FTT1103 (pro Francisella tularensis subsp. tularensis) je jedním z faktorů virulence u gramnegativní intracelulární bakterie Francisella tularensis. Protein FTT1103 je homologem k periplazmatickému proteinu DsbA E. coli, patří do rodiny disulfid oxidoreduktáz a je zodpovědný za tvorbu disulfidických vazeb u nově vzniklých proteinů. Tyto vazby jsou v proteinech nezbytné pro udržení správné konformace a aktivity. Bioinformatická analýza proteinu FTT1103 ukázala, že tento protein obsahuje N-koncovou FKBP doménu, u které se předpokládá dimerizační funkce a/nebo funkce chaperonová. Tyto funkce domény však nebyly dosud zcela potvrzeny. Cílem této diplomové práce bylo ověření, zda je N-koncová FKBP doména skutečně zodpovědná za správnou funkci a aktivitu proteinu DsbA. Pomocí molekulárně biologických metod jsme připravili mutantní gen dsbA s deletovanou FKBP_N doménou (dsbAΔFKBP_N). Tento gen jsme pomocí klonování vložili do plazmidu pET28b a tento...

Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Biochemical Sciences Candidate: Bc. Michaela Kohlová Supervizor: doc. PharmDr. Tomáš Šimůnek Supervizor - konsultant: Mgr. Monika Schmidt Title of diploma thesis: Cloning, expression and purification of Francisella tularensis disulfide oxidoreductase Conserved hypothetical lipoprotein called FTT1103 (for Francisella tularensis subsp. tularensis) is one of the virulence factors of gramnegative intracellular bacteria Francisella tularensis. This protein is homologue to protein E. coli Dsba. Periplasmatic protein DsbA is member of disulfide oxidoreductase family and it is responsible for disulfide bond formation in newly secreted proteins. The disulfide bonds are essential for right conformation and activity in the proteins. Biotransformatic analysis of protein FTT1103 showed, that this protein contains N-terminal FKBP domain. The domain has probably dimerization activity and it is expected to have chaperone activity too. The aim of the presented diploma thesis was to verify, if the domain FKBP_N is really responsible for correct function and activity of DsbA protein. Using molecular biology methods we prepared mutant gene with deleted domain FKBP_N (dsbAΔFKBP_N). We cloned this gene into plasmidplazmid E. coli pET28b,...