Detekce histidinem a FLAG peptidem značených rekombinantních proteinů

Abstract

Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Bc. Lenka Javorská Školitel: RNDr. Lucie Škarydová, Ph.D. Název diplomové práce: Detekce histidinem a FLAG peptidem značených rekombinantních proteinů Rekombinantní proteiny jsou proteiny produkované geneticky modifikovanými organismy, prostřednictvím rekombinantní DNA technologie, jejímž principem je vložení DNA sekvence kódující cílový protein do buněk expresního systému, který zajistí jeho produkci. Tato technologie umožňuje připravit v podstatě libovolný protein v jakémkoliv požadovaném množství. Rekombinantní proteiny jsou produkovány často ve formě fúzního proteinu s vhodnou afinitní značkou (např. histidinová nebo FLAG peptidová značka), která usnadní jejich purifikaci a detekci. Cílem této diplomové práce bylo zavést a optimalizovat univerzální metodu pro detekci rekombinantních proteinů značených histidinovou (6x histidin) a FLAG peptidovou značkou. Modelovým rekombinantním proteinem s histidinovou značkou byl enzym karbonylreduktasa 1 (CBR1) produkovaný expresním systémem bakterie Escherichia coli a pro rekombinantní proteiny značené FLAG peptidem enzymy DHRS12, HSD11β1, RODH4, DHRS3, DHRS7, DHRS8 (expresní systém - hmyzí buňky Sf9). Pro separaci proteinů byla zvolena SDS polyakrylamidová...

Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Biochemical Sciences Candidate: Bc. Lenka Javorská Supervisor: RNDr. Lucie Škarydová, Ph.D Title of diploma thesis: Detection of His-tag and FLAG-tag recombinant proteins Recombinant proteins are proteins produced in genetically modified organism by recombinant DNA technology that enable insert DNA sequence of target protein in expression cell. This technology allows preparation of actually any protein in any quantity without difficulties associated with demanding purification of native protein from tissues. Recombinant proteins are produced often in form of fusion proteins with suitable peptide tag (e.g. His-tag, FLAG- tag) that can help with their detection and enable simple purification. The aim of this diploma thesis was to introduce and optimize universal method for the detection of recombinant proteins labelled with His-tag (6x histidine) and FLAG-tag. The model recombinant protein with His-tag was enzyme carbonylreductase 1 (CBR1) produced by expression system Escherichia coli. For FLAG-tag labelled protein were chosen enzymes DHRS12, HSD11β1, RODH4, DHRS3, DHRS7, DHRS8 produced by insect cells (strain Sf9). SDS polyacrylamide electrophoresis for protein separation and immunochemical detection after Western...