Klonování, exprese a purifikace vybraného mykobakteriálního enzymu

Abstract

Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Řešitel: Michaela Švidrnochová Školitel: Mgr. Eva Novotná, Ph.D. Název diplomové práce: Klonování, exprese a purifikace vybraného mykobakteriálního enzymu Mycobacterium tuberculosis produkuje řadu enzymů, které jsou pro její růst a přežití nezbytnou součástí. Inhibice enzymů, účastnících se biosyntéz řady významných molekul bakterie, se stává potenciálním cílovým místem nových látek v léčbě tuberkulózy. Naftoátsyntasa je mykobakteriální enzym účastnící se biosyntézy menachinonu, který má zásadní význam pro elektronový transportní řetězec v anaerobním prostředí. Naftoátsyntasa (menB) patří do krotonové nadrodiny proteinů, katalyzuje přeměnu o-sukcinylbenzoyl-CoA (OSB-CoA) na 1,4-dihydroxy-2-naftoyl-CoA (DHNA-CoA). K přípravě rekombinantního proteinu menB byl použit plazmid pET-28b(+) a úsek DNA, kódující sekvenci menB, namnožený polymerázovou řetězovou reakcí. Zaligovaný plazmid byl transformován do buněk E.coli HB101 metodou tepelného šoku. Pro expresi byly použity expresní buňky E.coli BL21 a vlastní exprese byla indukována přidaním IPTG. Připravený protein byl izolován a přečištěn přístrojem Äkta, který vyžívá metod afinitní chromatografie.

Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Biochemical Sciences Candidate: Michaela Švidrnochová Supervisor: Mgr. Eva Novotná, Ph.D. Title of diploma thesis: Cloning, expression and purification of selected mycobacterial enzyme Mycobacterium tuberculosis produces many enzymes which are nescessary for its growing and living. Inhibition of enzymes participating in biosynthesis are a potential target of new drugs in treatement of tuberculosis. Naphtoate synthase is an mycobacterial enzyme in biosynthetic pathway of menaquinone. It has a crucial meaning in electron transport chain under anaerobic conditions. Naphtoate synthase belongs to crotonase superfamily, catalyses a conversion of o-succinylbenzoyl-CoA (OSB-CoA) into 1,4-dihydroxy-2-naphtoyl-CoA (DHNA-CoA). Plasmid pET-28b(+) and a segment of DNA encoding the sequence of menB amplified by polymerase chain reaction was used for preparation of recombinant protein menB. Ligated plasmid was transformed into the cells E. coli HB101 by heat shock. Expression cells E. colli BL21 were used for the expression and the expression itself was started by the addition of IPTG. Prepared protein was isolated and purified by a machine Äkta which used the method of affinity chromatography.