Klonování a exprese lidské AKR1A1

Abstract

Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Petra Kořínková Školitel: Prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. Název diplomové práce: Klonování a exprese lidské AKR1A1 Aldo-ketoreduktasa 1A1 (AKR1A1) je monomerní cytosolický enzym patřící do skupiny karbonyl redukujících enzymů, nadrodiny aldo-ketoreduktas. Rodina aldo- ketoreduktas se významně podílí na redukčních reakcích endogenních substrátů i první fáze biotransformace xenobiotik. V lidském organismu se nachází 15 zástupců této velké rodiny, které lze nalézt v různých tkáních. Největší zastoupení mají v hepatocytech a renálních buňkách. AKR1A1 katalyzuje reakce aromatických i alifatických aldehydů na jejich odpovídající alkoholy. Z endogenních látek je jeho substrátem mevalonát. Jeho významnými substráty jsou i některá léčiva ze skupiny antracyklinových antibiotik - doxorubicin a daunorubicin. Dále se podílí na biotransformaci sorbitolu a rozvoji diabetických komplikací. Příprava rekombinantního enzymu byla provedena v E. coli za pomoci expresního vektoru pET28b(+). Izolovaná cDNA byla namnožena polymerasovou řetězovou reakcí, katalyzována Phusion Hot Start II polymerasou za přítomnosti specifických primerů, obsahujících restrikční místa pro endonukleasy NdeI a XhoI, kterými byly naštěpeny...

Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Biochemical Sciences Candidate: Petra Kořínková Supervisor: Prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. Title of diploma thesis: Cloning and expression of human AKR1A1 The aldo-keto reductase 1A1 (AKR1A1) is monomeric cytosolic enzyme from aldo- keto reductase superfamily (AKR) with carbonyl reducing activity. The members of AKR superfamily have an important role in reductive reactions in metabolism of some endogenous substrates and in the first phase of biotransformation of xenobiotics. Fifteen members of this large family have been found in the human body. These proteins are expressed in different tissues within all our organism. The highest concentrations of proteins have been detected in the hepatocytes and in the renal cells. The function of AKR1A1 is to catalyse reductive reactions of aromatic and aliphatic aldehydes to the respective alcohols. Among its important substrates belong mevalonate (endogenous substance) and some drugs like anthracykline antibiotics - doxorubicin and daunorubicin. AKR1A1 also participates in biotransformations of sorbitol and in the development of diabetes complications. Preparation of recombinant protein was performed in E. coli with using of pET28b(+) as an expression vector. Isolated cDNA was...