Detekce poškození DNA a sledování jeho opravy

Abstract

Detekce poškození DNA a sledování jeho opravy Dagmar Kohoutová ABSTRAKT V této diplomové práci jsem se zabývala sledováním indukce a reparace křížových vazeb způsobených cis-platinou, k jejichž detekci byl použit modifikovaný kometo- vý test. Experimenty byly prováděny na liniích A-549, HeLa, HELF, XPA, XPC, CHO AA8 a CHO UV-20 (linie XPA, XPC a CHO UV-20 jsou deficitní v genech potřeb- ných pro korektní opravu poškozené DNA). Poškození bylo indukováno jednu hodinu 20, 40, 80 a 160 µM cis-Pt, reparace probí- hala po dobu 3 a 23 hodin. K detekci křížových vazeb byly buňky inkubovány v pří- tomnosti 800 µM styrenoxidu (SO), poté byla provedena alkalická verze kometového testu a analýza vzorků pomocí softwaru LUCIA® Comet Assay. Nejnižší indukce křížových vazeb po jedné hodině byla zaznamenána u buněčné li- nie A-549 a XPC (87 a 86 % DNA v ohonu), nejvyšší u CHO UV-20 (70 % DNA v oho- nu). Po čtyřech hodinách inkubace byl u všech buněčných linií pozorován nárůst poškození DNA křížovými vazbami (největší u linií HELF a XPA, % DNA v ohonu se snížilo o 49 a 48 %). Oprava poškozené DNA po 24 hodinách byla pozorována u buněč- ných linií A-549 (reparace 44, 68 % poškození) a CHO AA8 (odstraněno 33,12 % poško- zení). U ostatních linií byl pozorován další nárůst množství křížových vazeb. Na závěr byl proveden MTT test...

DETECTION OF THE DNA DAMAGE AND ITS REPAIR Dagmar Kohoutová ABSTRACT The subject of this thesis is the observation of induction and reparation of DNA cross-links induced by cis-platin (cis-Pt). The modified Comet Assay was used to detec- tion. The experiments were carried out on cell lines A-549, HeLa, HELF, XPA, XPC, CHO AA8 and CHO UV-20 (there are mutations in genes needed for keeping DNA unimpaired in cell lines XPA, XPC and CHO-UV 20). The damage was induced by presence of 20, 40, 80 and 160 µM cis-Pt for one hour. The cells were divided into three groups for reparation observations at one, three and twenty three hour marks. Then the cells were incubated with styrene oxide (SO) for 30 minutes to enable the detection of cross-links. Alkaline Comet Assay was carried out afterwards, software LUCIA® Comet Assay was used to analyse the samples. The cell lines A-549 and XPC showed the lowest induction of cross-links after one hour (87 and 86 % tail DNA), CHO-UV 20 showed the highest induction (70 % tail DNA). The number of cross-links rose after four hours in all types of used cell lines (the highest increase was observed in lines HELF and XPA, % tail DNA was reduced by 49 and 48 %). The reparation of DNA after 24 hours was registered in cell lines A-549 and CHO AA8 (44,68 % of cross-links was repaired in...