Modifikace glutathion-S-transferasy vybranými glykačními činidly

Abstract

Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Biochemical Sciences Candidate: Zuzana Průchová Supervisor: Prof. MUDr. Jaroslav Dršata, CSc. Title of diploma thesis: Modification of Glutathione S-transferase by selected glycating agents Glycation is a non-enzymatic reaction, which leads to the binding of carbonyl compounds to free amino groups of amino acids, peptides, proteins or other biomolecules. This process is closely related to impaired protein function in diabetes mellitus, during aging, and in neurodegenerative diseases. The main purpose of this thesis was to monitor the impact of several glycating agents on the properties of the enzyme glutathione S-transeferase (GST, EC 2.5.1.18) which plays a key role in the detoxification of many exogenous as well as endogenous compounds. Methylglyoxal (0.5-2 mM), glyceraldehyde (0.5-10 mM), glucose (50 mM), and fructose (50 mM) were selected as glycating agents. The course of protein glycation was evaluated by following methods: GST catalytic activity assessment, determination of primary amino groups, assessment of AGEs formation using fluorescence and Western blotting, generation of high molecular cross-links and aggregates by denaturationg polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), changes in GST molecular...

Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Zuzana Průchová Školitel: Prof. MUDr. Jaroslav Dršata, CSc. Název diplomové práce: Modifikace glutathion-S-transferasy vybranými glykačními činidly Glykace je neenzymová reakce, při které dochází k vazbě karbonylových sloučenin na volné aminoskupiny aminokyselin, peptidů, proteinů či jiných biomolekul. Tento proces je úzce spjat s poškozením funkce proteinů během diabetu mellitu, v průběhu stárnutí a při neurodegenerativních onemocněních. Hlavním předmětem této diplomové práce bylo sledování vlivu několika glykačních činidel na vlastnosti enzymu glutathion-S-transferasy (GST, EC 2.5.1.18), která hraje klíčovou roli při detoxifikaci řady exogenních i endogenních sloučenin. Zvolenými modelovými glykačními činidly byly methylglyoxal (0,5-2 mM), glyceraldehyd (0,5-10 mM), glukosa (50 mM) a fruktosa (50 mM). Průběh proteinové glykace byl hodnocen pomocí následujících metod: stanovení katalytické aktivity GST, stanovení obsahu primárních aminoskupin, hodnocení tvorby AGEs za použití fluorescence a Western blottingu, vznik vysokomolekulárních cross-linků a agregátů pomocí denaturující polyakrylamidové gelové elektroforézy (SDS-PAGE), změny v náboji molekuly GST metodou nativní PAGE. V průběhu měření se...