Role of disulphide bonds in hA2A subtype adenosine receptor

Abstract

Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická Fakulta v Hradci Králové Katedra Biochemicky věd Kandidát: Lukáš Zappe Vedoucí: Ing. Petra Matoušková Ph.D., PD Dr. Anke C. Schiedel Název diplomové práce: Role disulfidických vazeb u hA2A podtypu adenosinového receptoru Adenosinový receptor podtyp A2A je součástí rodiny receptorů spřažených s G proteinem (GPCR), která je nyní cílem téměř 40% všech léčivých látek. GPCRs se skládají ze sedmi transmembránových domén spojených třemi extracelulárními a třemi intracelulárními kličkami (ECL a ICL). Byla odkryta skutečná struktura receptoru, tedy víme, že ECL1 a ECL2 jsou spojeny disulfidickými vazbami. Z toho ECL2 je pravděpodobně zodpovědná za proces rozpoznání a navázání ligandu. Abychom lépe pochopili, jak důležitá je úloha těchto disulfidických vazeb v tomto procesu, pomocí přímé jednobodové mutace byly vytvořeny čtyři adenosinové A2A mutantní receptory, kde aminokyselina cystein byla nahrazena za serin (C146S, C159S, C166S a C146S-C159S). Ovlivnění receptorové exprese bylo zkoumáno pomocí metody ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay). Následný efekt na proces rozpoznání ligandu receptorem byl proveden pomocí kompetice mezi radioaktivně značeným ligandem [3 H]CGS-21680 (5 nM) a několika agonisty na adenosinových receptorech (NECA, CGS-21680, PSB-826,...

Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Biochemical Sciences Candidate: Lukáš Zappe Supervisor: Ing. Petra Matoušková Ph.D., PD Dr. Anke C. Schiedel Title of diploma thesis: Role of disulphide bonds in hA2A subtype adenosine receptor The adenosine A2A receptor belongs to the G protein coupled receptor family (GPCR). GPCRs are the targets of almost 40% of the drugs on the market. GPCRs are characterized by seven transmembrane helices, which are linked by three extracellular and three intracellular loops (ECL and ICL). The structure of the receptor has been revealed by crystallography, hence we know that ECL1 and ECL2 are connected by several disulphide bonds. The ECL2 is believed to be involved in ligand binding and recognition. In order to understand the relevance of those disulphide bonds involved in this process, four adenosine A2A receptor mutants were generated by one-site direct mutagenesis, in which the cysteine residues were replaced with serine residues (C146S, C159S, C166S and C146S- C159S). These receptor mutants were expressed in the mammalian cell line, CHO K1(Chinese Hamster Ovary) and the receptor expression was tested with ELISA (Enzyme- linked immunosorbent assay). The determination of ligand binding has been carried out by radioligand...