Volné cirkulující nukleové kyseliny v krevní plazmě

Abstract

Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Bc. Kateřina Totzauerová Školitel: Doc. PharmDr. Martin Beránek, Ph.D. Název diplomové práce: Volné cirkulující nukleové kyseliny v krevní plazmě Cíl práce: Cílem této práce bylo porovnat různé komerčně dostupné soupravy pro extrakci DNA a vyhodnotit podle optických charakteristik, výsledků z qPCR a záchytu a výtěžnosti krátkých fragmentů všestranně optimální metodu pro rutinní izolaci volné cirkulující DNA ze vzorků krevní plazmy. Metody: Pro porovnání extrakčních metod byly zvoleny celkem čtyři komerčně dostupné soupravy: QIAmp DNA Blood Mini Kit, NucleoSpin Plasma XS Kit, QIAmp DSP Virus Spin Kit a Agencourt Genfind v2. DNA byla izolována z alikvotů směsné plazmy zdravých jedinců. Po extrakci byla plazmatická DNA kvantifikována spektrofotometricky, fluorimetricky a kvantitativní polymerázovou řetězovou reakcí. Zároveň byla u vybraných vzorků provedena fragmentační analýza pomocí kapilární elektroforézy. Výsledky: Nejlepší výtěžnost a čistotu poskytla metoda od firmy Qiagen QIAmp DSP Virus Spin Kit s průměrnou hodnotou koncentrace stanovené qPCR 49,95 ± 23,57 ng/ml a s nejvyššími hodnotami fluorescence při fragmentační analýze u všech fragmentů kromě nejkratšího. Druhé nejlepší výsledky poskytla...

Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Biochemical Sciences Candidate: Bc. Kateřina Totzauerová Supervisor: Doc. PharmDr. Martin Beránek, Ph.D. Title of diploma thesis: Free circulating nucleic acids in blood plasma Outline: The aim of this thesis was to compare various commercially available DNA extraction kits and choose the universally optimal method for routine isolation of free circulating DNA from blood plasma samples according to their optical characteristics, the qPCR results and yield of short fragments. Methods: Four commercially available methods of extraction have been chosen to compare: QIAmp DNA Blood Mini Kit, QIAmp DSP Virus Spin Kit (both Qiagen), NucleoSpin Plasma XS (Macherey-Nagel) and Agencourt Genefind v2 (Beckman Coulter). DNA was isolated from aliquots of a pooled blood plasma of healthy individuals. Plasmatic DNA was quantified after extraction by spectrophotometry, fluorimetry and quantitative polymerase chain reaction. Fragmentation analysis on selected samples by capillary electrophoresis was also realized. Results: The best yield and purity provided the method from Qiagen QIAmp DSP Virus Spin Kit. Average value of the concentration determined qPCR was 49.95 ± 23.57 ng/mL and it gave the highest values of the fluorescence of...