Cell-free expression of a voltage-gated sodium channel for future 2D IR spectroscopic studies

Abstract

Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Gabriela Kovácsová Školitel: Dr. Sebastian Peuker, Prof. RNDr. Lenka Skálová, Ph.D. Název diplomové práce: Bezbuněčná exprese napěťově řízeného sodíkového kanálu pro budoucí 2D IR spektroskopické studie Napěťově řízené sodíkové kanály (Nav), membránové proteiny z nadrodiny napěťově řízených iontových kanálů, jsou součástí každé excitabilní buňky, kde se podílejí na propagaci akčních potenciálů změnou propustnosti její membrány pro sodíkové ionty. Eukaryotní Nav jsou tvořeny jedním pseudo-homotetramerickým polypeptidem, ve kterém se čtyřikrát opakuje šest transmembránových segmentů (S1-S6). S1-S4 tvoří napěťový senzor reagující na změny napětí na membráně a S5 spolu s S6 tvoří samotný pór kanálu, na jehož extracelulárním ústí je selektivní filtr rozeznávající sodíkové ionty. Zatímco iontová selektivita napěťově řízených draselných kanálů byla detailně popsána na molekulární úrovni, málo je známo o principu selektivity u Nav. Studie selektivního filtru pomocí 2D IR spektroskopie, což je metoda schopná poskytnout strukturní informace o daných vazebných interakcích s časovým rozlišením na pikosekundy až milisekundy, vyžaduje velké množství vyčištěného proteinu. To je těžké získat v případě eukaryotních...

Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Biochemical Sciences Candidate: Gabriela Kovácsová Supervisor: Dr. Sebastian Peuker, Prof. RNDr. Lenka Skálová, Ph.D. Title of diploma thesis: Cell-free expression of a voltage-gated sodium channel for future 2D IR spectroscopic studies Voltage-gated sodium channels (Navs) are membrane proteins from the superfamily of voltage-gated ion channels (VGIC), and are present in every excitable cell where they participate in the propagation of action potentials by changing the Na+ permeability of the cell membrane. Eukaryotic Navs are pseudo homotetrameric polypeptides, comprising four repeats of six transmembrane segments (S1-S6), where S1 to S4 form the voltage-sensing domain and S5 and S6 create the pore domain with the selectivity filter on the extracellular site. Whereas the ion selectivity of the voltage-gated potassium channels has been elucidated on the molecular level in great detail, little is known about this for the voltage-gated sodium channels. To allow future studies of the selectivity filter of Nav by the means of 2D IR spectroscopy, a technique able to provide bond-specific structural information on the picosecond to millisecond time scales, large quantities of the purified channel are needed. Eukaryotic Navs...