Optimalizace transfekcí eukaryontních buněčných linií

Abstract

Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Bc. Iva Šplíchalová Vedoucí diplomové práce: RNDr. Lucie Škarydová, Ph.D. Školitel specialista: Mgr. Vojtěch Vejvoda, Ph.D. Název diplomové práce: Optimalizace transfekcí eukaryontních buněčných linií Optimalizace transfekce je proces, při kterém hledáme nejlepší podmínky pro transfekci. Tento proces předchází každé rutinní výrobě rekombinantních proteinů v laboratoři. Nejprve se volí expresní systémy, které by nejlépe vyhovovaly konkrétním požadavkům. Pří výběru se musí zohlednit rychlost, ekonomičnost a funkčnost vzniklého rekombinantního proteinu, která může být ovlivněna posttranslačními modifikacemi expresních systémů. Pro vnášení cílových genů do expresních systémů se využívá expresních vektorů. Cílem diplomové práce bylo optimalizovat podmínky pro transfekci eukaryontních buněčných linií CHO PF a HEK293 za pomoci tří komerčně dostupných kitů. Po optimalizaci následovalo srovnání transfekční účinnosti s doposud používanými transfekčními postupy ve firmě Generi biotech s.r.o. Pro optimalizace byl použit plazmid pMaxGFP. Účinnost transfekce byla hodnocena pomocí Neubauerovy komůrky a kvantifikací GFP v buněčném lyzátu. Pro ...

Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Biochemical Sciences Candidate: Bc. Iva Šplíchalová Supervisor: RNDr. Lucie Škarydová, Ph.D. External supervisor: Mgr. Vojtěch Vejvoda, Ph.D. Title of Master thesis: Optimization of Transfection of Eukaryotic Cells An optimization of a transfection is a process of searching for the best conditions for the transfection. Expression systems corresponding to concrete requirements are chosen first of all. A speed, an economy and a functionality of prepared recombinant protein that can be influenced by posttranslational modifications must be considered. Expression vectors are used to insert genes of the interest into expression systems. The goal of this diploma thesis was to optimize conditions for transfection of eukaryotic cell lines CHO PF a HEK293 using of three commercially available kits. It was followed by a comparison of these transfection efficiency with standard procedures that are used in the company Generi Botech s.r.o. A plasmid pMaxGFP was used for the optimization. A cell counting in Neubaurer's chamber and a quantification of GFP in cell lysate were used to evaluate the efficiency of the transfection. Commercially available kits ...