Příprava savčích vektorů kódujících vybrané mikrosomální SDR enzymy

Abstract

Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických v d Kandidát: Jan Slezák kolitel: RNDr. Jakub Hofman, Ph.D. Název diplomové práce: P íprava sav ích vektor kódujících vybrané mikrosomální SDR enzymy Mikrosomální dehydrogenasy/reduktasy s krátkým et zcem DHRS1, DHRS7 a HSD11b1 (SDR19C1, SDR34C1, SDR26C1) jsou membránov vázané NAD(P)H-dependentní enzymy metabolizující iroké spektrum substrát nesoucích karbonylovou skupinu. Tyto enzymy z nadrodiny dehydrogenas/reduktas s krátkým et zcem zprost edkovávají metabolismus endogenních látek, jako jsou glukokortikoidy, retinoidy, sfingolipidy stejn jako r zná xenobiotika. Mimo jejich biologické role se podílejí na rozvoji záva ných onemocn ní (nap . nádorová onemocn ní, Alzheimerova choroba, obesita aj.). Znalost inhibi ní a substrátové specifity m e vést k lep ímu pochopení funkcí t chto enzym v organismu a k novým terapeutickým p ístup m. Cílem této práce bylo p ipravit sav í vektory kódující DHRS1, DHRS7 a HSD11b1. Prvním krokem byl návrh primer a amplifikace cDNA. Primery nesly sekvence rozeznávané restrik ními endonukleasami sou asn obsa ené v mnoho etném klonovacím míst pCI plasmidu, co umo nilo vytvo ení lepivých konc a následné spojení insertu s plasmidem pomocí ligace. Takto p ipravené vektory byly...

Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradci Kralove Department of Biochemical Sciences Candidate: Jan Slezák Superviser: RNDr. Jakub Hofman, Ph.D. Title of diploma thesis: Preparation of mammalian vectors encoding selected microsomal SDR enzymes Microsomal short-chain dehydrogenases/reductases DHRS1, DHRS7 and HSD11b1 (SDR19C1, SDR34C1, SDR26C1) are membrane-bound NAD(P)H-dependent enzymes metabolizing a broad spectrum of carbonyl-bearing substrates. These enzymes from the superfamily of short-chain dehydrogenases/reductases mediate metabolism of endogenous compounds, such as glucocorticoids, retinoids, sfingolipids as well as various xenobiotics. Apart from their biological roles, they participate in the etiology of severe diseases (e.g cancer, Alzheimer disease, obesity etc.). Knowledge of inhibitory and substrate affinity may lead to better understanding of the functions of these enzymes in organism and to the development of new therapeutic approaches. The goal of the present work was to prepare mammalian vectors encoding DHRS1, DHRS7 and HSD11b1. Primer design and cDNA amplification were among the first steps. Primers beared the sequence recognized by restriction endonucleases which was concomitantly present in the multicloning site of the pCI plasmid. Such primer design allowed...