Vývoj HPLC metody pro stanovení vitaminu B1 v klinickém výzkumu

Abstract

Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra analytické chemie Kandidát: Anežka Chadtová Školitel: RNDr. Lenka Kujovská Krčmová Ph.D. Název diplomové práce: Vývoj HPLC metody pro stanovení vitaminu B1 v klinickém výzkumu Předkládaná diplomová práce popisuje vývoj a částečnou validaci nové HPLC metody pro stanovení vitaminu B1 (thiamin hydrochloridu) a jeho fosforylovaných derivátů (thiamin monofosfátu, thiamin pyrofosfátu). Tato metoda je založena na využití kapalinové chromatografie s nepřímou fluorescenční detekcí. Separace bylo dosaženo využitím moderní monolitní stacionární fáze druhé generace Chromolith® High Resolution RP-18e 100 x 4,6 mm (Merck, Německo) v kombinaci s gradientovou elucí mobilní fáze, kterou tvoří směs 95% fosfátového pufru 10 mmol/l o pH 6,5 a 5% acetonitrilu (ACN), průtoková rychlost mobilní fáze byla 2,5 ml/min, od 2,1. min 4 ml/min. Pro fluorescenční detekci thiamin hydrochloridu (TH), thiamin monofosfátu (TMP) a thiamin pyrofosfátu (TPP, thiamin difosfátu) byla nutná jejich chemická oxidace hexakynoželezitanem draselným na thiochrom a jeho adekvátní estery, které mají fotoluminiscenční aktivitu. Chromatografická metoda byla částečně validována, byl stanoven faktor symetrie, účinnost kolony, rozlišení chromatografických píků, limit detekce a...

Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Analytical Chemistry Candidate: Anežka Chadtová Supervisor: RNDr. Lenka Kujovská Krčmová Ph.D. Title of diploma thesis: Development of HPLC method for determination of vitamin B1 in clinical research The present thesis describes the development and partial validation of the new HPLC method for determination of vitamin B1 (thiamine hydrochloride) and its phosphorylated derivatives (thiamine monophosphate, thiamine pyrophosphate). This method is based on the use of liquid chromatography with indirect fluorescence detection. Separation was achieved using modern second generation monolithic stationary phase High Resolution Chromolith RP-18e 100 x 4.6 mm (Merck, Germany) in combination with gradient elution. Mobile phase was consisting of the mixture of 95% phosphate buffer 10 mmol / l pH 6 5 and 5% acetonitrile (ACN), flow rate of the mobile phase was 2.5 ml / min, from 2.1. min 4 ml / min. For fluorescence detection of thiamin hydrochloride (TH), thiamin monophosphate (TMP) and thiamine pyrophosphate (TPP, thiamine diphosphate) was necessary to use chemical oxidation by potassium ferricyanide to thiochrome and its adequate esters having photoluminescence activity. Chromatographic method has been partially validated. Peak...