Vyhledání referenčních genů pro relativní kvantifikaci mRNA z Haemonchus contortus

Abstract

Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Michaela Růžičková Školitel: Ing. Petra Matoušková, Ph.D. Název diplomové práce: Vyhledání referenčních genů pro relativní kvantifikaci mRNA z Haemonchus contortus Haemonchus contortus je parazitická hlístice, jejíž multirezistence k anthelminti- kům je celosvětovým problémem ohrožujícím hlavně chovy malých přežvý- kavců. V roce 2013 byl publikován její genom a transkriptom, což umožnilo rozsáhlý výzkum genové exprese. Referenční geny pro tyto studie prozatím ne- byly stanoveny. Použití vhodných referenčních genů je nezbytné pro správnou normalizaci hladin exprese genů. Cílem této práce bylo navrhnout a zhodnotit potenciální referenční geny pro studie genové exprese u dospělců H. contortus. Navrženo bylo 11 genů, stabilita jejich exprese byla hodnocena na samcích a sa- micích dvou kmenů H. contortus, jednoho na anthelmintika vnímavého (ISE) a druhého multirezistentního (WR). Z jedinců byla extrahována RNA, přepsána reverzní transkripcí do cDNA. Tato byla zředěna a analyzována kvantitativní real-time PCR s detekcí pomocí SYBR Green I. Stabilita exprese byla hodnocena počítačovými programy BestKeeper, geNorm, NormFinder a komparativní CT metodou. Nejstabilnějšími geny se jeví ncbp, ama, sodc, gapdh a...

Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Biochemical Sciences Candidate: Michaela Růžičková Supervisor: Ing. Petra Matoušková, Ph.D. Title of diploma thesis: Reference gene selection for mRNA quantification in Haemonchus contortus Haemonchus contortus is a parasitic nematode, whose multiresistance to ant- helmintics means global problem, threatening mostly small ruminants farming. Genom and transcriptom have been published in 2013, allowing gene expression studies to be conducted. Reference genes for this studies have not been validated yet. Use of suitable reference genes is essential for accurate normalization of gene expression levels. Aim of this work was to identify and validate potential reference genes for gene expression studies in H. contortus adults. Eleven genes were chosen, stability of their expression was assessed in males and females of two H. contortus strains, one drug-susceptible (ISE) and one multi-drug-resistant (WR). Total RNA was extracted and reverse trancribed to cDNA. cDNA was diluted and analyzed using quantitative real-time PCR with SYBR Green I detection. Expression stability was evaluated by computer programs BestKeeper, geNorm, NormFinder and the comparative CT method. Ncbp, ama, sodc, gapdh and farb were found to be most stable...