Optimalizace metod pro stanovení aktivace receptoru CD44

Abstract

Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biologických a lékařských věd Název diplomové práce: Optimalizace metod pro stanovení aktivace receptoru CD44. CD44 je transmembránový glykoprotein přítomný na většině buněčných typů, který je zapojen do řady fyziologických i patologických procesů, taktéž představuje hlavní receptor pro kyselinu hyaluronovou (HA). HA je nesulfatovaný glykosaminoglykan, přítomný ve velké míře v extracelulární hmotě, kde zajišťuje hydrataci buněk, je zapojen do nádorových procesů, ovlivňuje buněčnou migraci, podporuje angiogenezi, podílí se na hojení ran. V této práci jsme se zaměřili na optimalizaci metod sledujících aktivaci, množství a štěpení receptoru CD44 u buněčné linie HT-29. Pomocí metod Western Blot, ELISA a průtokové cytometrie jsme pozorovali množství celkového receptoru a jeho rozštěpených domén. K aktivaci jsme využili HA o molekulové hmotnosti 71 kDa a PMA (Phorbol-12-Myristate-13-Acetate). Po aktivaci došlo k časově závislým změnám množství celkového CD44 i jeho fragmentů. Sledovali jsme také buněčnou smrt v závislosti na přítomnosti HA a PMA. Neprokázali jsme žádný významný vliv těchto látek na viabilitu buněk. Pro vizuální vyhodnocení translokace odštěpené intracelulární domény do jádra jsme použili fluorescenční a konfokální...

Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Biological and Medical Sciences Title of diploma thesis: Optimalisation of methods for determination of CD44 receptor activation. CD44 is a transmembrane glycoprotein present in most cell types which is involved in many physiological and pathological processes and it represents the main hyaluronic acid (HA) receptor. HA is a nonsulfated glycosaminoglycan that is present extensively in extracellular matrix, where it provides cell hydratation. HA is involved in cancer, affects cell migration, supports an angiogenesis and participates in wound healing. In this study, we focused on the optimization of methods for the evaluation of activation, the amount and cleavage of CD44 receptor in HT-29 cell line. We observed the total amount of the receptor and its cleaved domains using methods Western Blot, ELISA and flow cytometry. We used HA molecular weight 71 kDa and PMA (Phorbol- 12-Myristate-13-Acetate) for activation. Time-dependent changes appeared in the amount of total CD44 and its fragments after activation. We also observed cell death depending on the presence of HA and PMA. We demonstrated no significant effects of these substances on cell viability. We used fluorescent and confocal microscopy for visual evaluation of...