Limbal stem cell transplantation and their utilization for ocular surface reconstruction.

Abstract

Cíle: Deficit limbálních kmenových buněk (LSC) patří mezi nejzávažnější onemoc- nění povrchu oka. Cílem dizertační práce bylo studium obnovy poškozeného povrchu oka. Proto byla zavedena limbální transplantace v experimentálním myším modelu. Byla provedena izolace LSC, přenos LSC a mesenchymálních kmenových buněk (MSC) izolovaných z kostní dřeně na nanovláknových nosičích na povrch poškozeného oka u myší a u králíků. Materiály a metody: U myší BALB/c byla provedena syngenní, alogenní a xenogenní limbální transplantace. Po transplantaci byla sledována doba přežívání štěpů, imunitní reakce a účinky monoklonálních protilátek (mAb) (anti-CD4 a anti-CD8). Myší LSC byly rozděleny pomocí centrifugace na Percollovém gra- dientu a následně byla provedena analýza povrchových znaků LSC pomocí PCR a průtokové cytometrie. Na myším a králíčím modelu byly přenášeny LSC a MSC pomocí nanovláknových nosičů na poškozený povrch oka. Byl sledován in vitro růst buněk na nosičích, pooperační zánětlivá reakce a přežívání buněk na povrchu oka po přenosu nosičů. Výsledky: K odhojení alogenních limbálních štěpů došlo promptně a v průběhu rejekce převažovala Th1 imunitní odpověď (IL-2, IFN-γ)...

Aims: Limbal stem cell (LSC) deficiency is one of the most challenging ocular surface diseases. The aim of this thesis was to study damaged ocular surface reconstruction. Therefore, a mouse model of limbal transplantation was estab- lished. Furthermore, LSC isolation, transfer of LSCs and bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) on nanofiber scaffolds were studied. Material and methods: Syngeneic, allogeneic and xenogeneic (rat) limbal grafts were transplanted orthotopically into BALB/c mice. Graft survival, immune re- sponse and the effect of monoclonal antibodies (mAb) (anti-CD4 and anti-CD8 cells) were analyzed. Mouse LSCs were separated by Percoll gradient; subse- quently, they were analyzed for the presence of LSC and differentiation corneal epithelial cell markers and characteristics using real-time PCR and flow cytom- etry. Nanofiber scaffolds seeded with LSCs and MSCs were transferred onto the damaged ocular surface in mouse and rabbit models. Cell growth on scaffolds, post-operative inflammatory response and survival of transferred cell were ana- lyzed. Results: Limbal allografts were rejected promptly by the Th1-type of immune response (IL-2, IFN-γ) involving CD4+ cells and nitric oxide produced by macro- phages, contrary to the prevailing Th1 and Th2 immune responses (IL-4, IL-10) in...