Purifikace a charakterizace membránově vázané reduktasy z lidské jaterní tkáně

Abstract

Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Biochemical Sciences Candidate: Mgr. Vendula Pelcová Supervisor: Prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. Title of rigorous thesis: Purification and characterization of membrane-bound reductase from human liver. This study was focused on implementation of experimental techniques for purification of human liver microsomal fraction. There were chosen three basic steps of purification process. As a first step, ion-exchange chromatography was chosen followed by two purification steps on the base of gel filtration. Before purification the microsomal fraction had to be solubilized to release proteins from membrane bounds and conditions had to be optimized. Single fractions were subsequently incubated with specific substrate of reductases oracin and the quantity of metabolite 11-dihydroracin was assessed by achiral HPLC analysis. For the most active fractions the SDS-PAGE analysis was done to set size of unknown enzyme. By use of antibody against 11beta-HSD1 was axcleded the presence of this reductase in all analyses fractions. By use of described purification techniques we were successful to concentrate fraction with unknown human liver reductase.

Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Mgr. Vendula Pelcová Školitel: Prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. Název rigorózní práce: Purifikace a charakterizace membránově vázané reduktasy z lidské jaterní tkáně. Tato práce byla zaměřena na zavedení experimentálních technik pro purifikaci lidské jaterní mikrosomální frakce. Byly zvoleny tři základní kroky purifikačního schématu. Jako první krok byla zařazena iontově výměnná chromatografie na silném anexu následována dvěma separacemi na koloně pro gelovou filtraci. Před purifikací bylo nutno mikrosomální frakci solubilizovat, aby se uvolnily proteiny z vazby na membránu a podmínky optimalizovat. Jednotlivé najímané frakce byly následně inkubovány se specifickým substrátem reduktas oracinem a množství vzniklého metabolitu 11-dihydrooracinu bylo stanoveno pomocí achirální HPLC analýzy. U nejaktivnějších frakcí byla provedena SDS- PAGE a určena velikost hledaného enzymu. Použitím protilátky na 11beta-HSD1 byla vyloučena přítomnost této reduktasy v analyzovaných frakcích. S využitím popsaných purifikačních technik se podařilo zakoncentrovat frakci s dosud nepopsanou lidskou jaterní reduktasou.