Vliv přídavku nosiče na izolaci volně cirkulujících nukleových kyselin z krevní plazmy

Abstract

Univerzita Karlova Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Bc. Radka Vaňková Školitel: doc. PharmDr. Martin Beránek, Ph.D. Název diplomové práce: Vliv přídavku nosiče na izolaci volně cirkulujících nukleových kyselin z krevní plazmy Cíl práce: Cílem této práce bylo porovnat výtěžky volné cirkulující fragmentované DNA (cfDNA) extrahované ze vzorků krevní plazmy s přídavkem komerčně dostupných nosičů. Na základě výsledků real-time polymerasové řetězové reakce (qPCR) byl vybrán nejoptimálnější nosič pro rutinní izolaci cfDNA ze vzorků krevní plazmy. Metody: Kolonkovou extrakční metodou NucleoSpin Plasma XS Kit (Macherey-Nagel) byla z alikvotů směsné plazmy izolována cfDNA. Celkem bylo použito 7 typů nosičů, a to nosičová RNA (Qiagen), glykogen (Invitrogen), polyadenylová kyselina (Roche), lineární polyakrylamid (Invitrogen), kvasinková transferová RNA (Ambion), DNA ze spermatu lososa (Invitrogen), DNA ze spermatu sledě (Promega). Následně byla plazmatická DNA kvantifikována spektrofotometricky, fluorimetricky a pomocí qPCR. Výsledky: Nejlepších výsledků bylo dosaženo s přídavkem polyadenylové kyseliny o finální koncentraci 1,55 µg/ml. Výtěžnost cfDNA se přídavkem nosičové RNA a polyadenylové kyseliny o finálních koncentracích 1,55 µg/ml a 0,1 µg/ml signifikantně...

Charles University Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Biochemical Sciences Candidate: Bc. Radka Vaňková Supervisor: doc. PharmDr. Martin Beránek, Ph.D. Title of diploma thesis: Influence of Carrier Molecule Addition on Plasma Free Circulating Nucleic Acid Extraction Outline: The aim of this thesis was to compare the yields of cell-free DNA (cfDNA) extracted from blood plasma specimens with the addition of commercially available carrier molecules. According to the real-time polymerase chain reaction (qPCR) results, we chose the most optimal carrier molecules for routine isolation of cfDNA from blood plasma samples. Methods: cfDNA was isolated from aliquots of a pooled blood plasma by spin column extraction method NucleoSpin Plasma XS (Macherey-Nagel). We used 7 different types of carrier molecules as RNA carrier (Qiagen), Glycogen (Invitrogen), Poly (A) Polyadenylic acid (Roche), Linear Acrylamide (Invitrogen), Yeast transfer RNA (Ambion), Salmon sperm DNA (Invitrogen), Herring sperm DNA (Promega). After the extraction, plasmatic DNA with the addition of carrier molecules was quantified by spectrophotometry, fluorimetry and qPCR. Results: The best results were achieved with the addition of polyadenylic acid with final concentration of 1.55 μg/ml. The addition of carrier RNA and...