Identifikace nových substrátů Ser/Thr proteinkinázy StkP

Abstract

Streptococcus pneumoniae kóduje ve svém genomu jedinou unikátní serin/threoninovou proteinkinázu StkP a k ní příslušnou proteinfosfatázu PhpP. Tento signalizační pár fosforyluje/defosforyluje mnoho cílových proteinů zúčastněných v celé řadě buněčných procesů. Dosud však bylo charakterizováno pouze několik z nich. Analýzou globálního fosfoproteomu mutantního kmene na pozadí ∆stkP kmene byl identifikován fosfoprotein Spr0175 a určen fosforylovaný zbytek Thr7. Cílem této diplomové práce byla charakterizace tohoto nového substrátu. Byly připraveny ∆spr0175 mutantní kmeny na genetickém pozadí Rx a R6 divokých kmenů, u kterých byl monitorován růst a buněčná morfologie. Testované mutantní kmeny měly morfologické defekty znamenající pravděpodobnou účast Spr0175 v procesu buněčného dělení. V divokém kmeni D39 byla delece genu spr0175 neúspěšná, což znamená možnou esencialitu Spr0175 u kmene D39. Získané výsledky dále potvrzují, že je protein Spr0175 v in vitro i in vivo podmínkách modifikován na threoninu v pozici 7. V in vitro podmínkách byla také prokázána minoritní fosforylace na zbytku T4. V in vivo experimentu bylo pomocí koimunoprecipitace zároveň prokázáno, že protein Spr0175 vytváří oligomerní struktury. Dalším cílem diplomové práce byla buněčná lokalizace Spr0175. Fluorescenční mikroskopií bylo...

Streptococcus pneumoniae encodes single serine/threonine protein kinase StkP and its cognate protein phosphatase PhpP. This signalling couple phosphorylates/dephosphorylates many target proteins involved in various cellular processes. So far, only few ot them was characterized in detail. Global phosphoproteomic analysis in the ∆stkP mutant strain background resulted in the identification of protein Spr0175 as phosphorylated on threonine 7. The main aim of this work was to characterize this new substrate. The ∆spr0175 mutant strains were prepared in the wild type genetic background Rx and R6 and then monitored for their growth and cell morphology. Mutant strains exhibited morphological defects revealing potential involvement of Spr0175 in the process of cell division. In the wild type D39 the deletion was unsuccesful, which may entail possible essentiality of Spr0175 in D39 strain. The results obtained also confirmed that the Spr0175 is modified in in vitro and in vivo conditions at threonine 7. In vitro study also confirmed minor phosphorylation at T4 residue. By using co-immunoprecipitation assay we demonstrated that Spr0175 protein can form oligomeric structures. Another aim of this work was cellular localization of Spr0175. By using fluorescent microscopy we showed that GFP-Spr0175 fusion...