Peptidové mapování bioléčiv pomocí CE

Abstract

Univerzita Karlova Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra analytické chemie Kandidát: Dmytro Kosolapov Školitel: PharmDr. Pavel Jáč, Ph.D. Konzultant: PharmDr. Juraj Lenčo, Ph.D. Název diplomové práce: Peptidové mapování bioléčiv pomocí CE Tato práce se zabývá optimalizací kapilárně elektroforetické (CE) metody pro peptidové mapování a enzymatického štěpení proteinů pomocí trypsinu. Jako substrát pro enzymatické štěpení byl použit koňský myoglobin a referenční protilátka. Byly testovány dvě metody štěpení: konvenční štěpení trypsinem v roztoku a štěpení za využití komerční soupravy Smart Digest Trypsin Kit, která využívá imobilizovaný trypsin. Štěpení bylo kontrolováno pomocí RP- HPLC. Po optimalizaci tryptického štěpení byla provedena řada pokusů pro stanovení optimálních podmínek pro kvalitní separaci hydrolyzátu pomocí CE. Všechna měření se prováděla v PVA-kapiláře s vnitřním průměrem 50 µm, efektivní délkou 56 cm a celkovou délkou 64,5 cm. Vzorek byl dávkován hydrodynamicky za tlaku 50 mbar, vkládané napětí mělo hodnotu 30 kV, teplota kapiláry byla nastavena na 20 řC. Zóny analytů byly zaznamenávány UV-VIS detektorem při vlnové délce 200 nm. Byl testován vliv koncentrace a typu základního elektrolytu (30, 60, 90, 120, 150mM kyselina mravenčí a 0,5%, 1%, 1,5%, 2% kyselina octová), doby...

Charles University Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Analytical Chemistry Candidate: Dmytro Kosolapov Supervisor: PharmDr. Pavel Jáč, PhD. Consultant: PharmDr. Juraj Lenčo, Ph.D. Title of graduation thesis: Peptide Mapping of Biopharmaceuticals Using CE This work focuses on optimization of capillary electrophoresis (CE) method for the peptide mapping. and enzymatic digestion of proteins using trypsin. Myoglobin from equine heart and a reference antibody were used as substrates. Two digestion approaches were compared: a conventional tryptic digestion in solution and digestion with a commercial SMART Digest Trypsin Kit that is based on immobilized trypsin. The digestion was monitored with RP-HPLC. After a short optimization of tryptic digestion, a number of experiments were carried out to determine the optimal conditions for peptide mapping by means of CE. All the measurements were carried out using a PVA-coated capillary of 50 µm internal diameter, effective length of 56 cm and total length of 64.5 cm. Samples were applied hydrodynamically at a pressure of 50 mbar, the separation voltage was 30 kV, the temperature of the capillary was set to 20řC. The analytes were detected with UV-VIS detector at 200 nm. The effect of BGE type and concentration (30, 60, 90, 120, 150 mM formic acid...