Top-down, middle-up a bottom-up RPLC analýzy biofarmaceutik pomocí jedné kolony

Abstract

Charles University, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Analytical Chemistry Candidate: Bc. Ondřej Hývnar Supervisor: PharmDr. Juraj Lenčo, Ph.D. Title of diploma thesis: Top-down, middle-up and bottom-up RPLC analyses of biopharmaceuticals using a single column Nowadays, different columns are needed for top-down, middle-up and bottom-up analyses of biopharmaceuticals using liquid chromatography. The aim of this thesis was to determine whether it is possible to use for all these types analyses a new column BioResolve RP mAb Polyphenyl of the company Waters, intended mainly for top-down and middle-up analyses. The biopharmaceuticals trastuzumab, bevacizumab, panitumumab and aflibercept were analyzed as intact for top-down analysis, reduced, cleaved by IdeS protease, cleaved by IdeS protease and reduced for middle-up analysis and cleaved by endopeptidase Lys-C and trypsin for bottom-up analysis. Top-down and middle-up analyses were performed using liquid chromatography with UV detection. We verified the ability of the column to analyze biopharmaceuticals prepared this way in our conditions. We found that although the column can handle intact biopharmaceuticals, it gives better results in middle-up analyses. Bottom-up analyzes were performed using liquid chromatography coupled with...

Univerzita Karlova, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra analytické chemie Kandidát: Bc. Ondřej Hývnar Školitel: PharmDr. Juraj Lenčo, Ph.D. Název diplomové práce: Top-down, middle-up a bottom-up RPLC analýzy biofarmaceutik pomocí jedné kolony V současné době jsou pro top-down, middle-up i bottom-up analýzy biofarmaceutik pomocí kapalinové chromatografie potřeba různé kolony. Hlavním cílem této práce bylo zjistit, jestli je možné použít na všechny tyto typy analýz novou kolonu BioResolve RP mAb Polyphenyl firmy Waters, určenou primárně k top-down a middle-up analýzám. Analyzovány byly biofarmaceutika trastuzumab, bevacizumab, panitumumab a aflibercept a to jako intaktní pro top-down analýzy, redukované, štěpené proteázou IdeS, štěpené proteázou IdeS a redukované pro middle-up analýzy a štěpené endopeptidázou Lys-C a trypsinem pro bottom-up analýzy. Top-down a middle-up analýzy byly provedeny na kapalinovou chromatografií s UV detekcí. Ověřovali jsme při nich schopnost kolony analyzovat takto připravené biofarmaceutika v našich podmínkách. Zjistili jsme, že přestože si kolona dokáže poradit i s intaktními biofarmaceutiky, tak lepší výsledky podává při middle-up analýzách. Bottom-up analýzy byly provedeny kapalinovou chromatografií ve spojení s hmotnostní spektrometrií a zde byla kolona...