Novel substrates of cullin-RING ubiquitin ligases: identification and functional characterisation

Abstract

Selektivní degradace proteinů ubikvitin-proteazomovým systémem je nezbytná pro udržování buněčné homeostázy a regulaci celé řady biologických procesů. Selektivita tohoto systému je dána stovkami ubikvitin ligáz, které specificky rozeznávají proteiny určené k degradaci (tzv. substráty) a katalyzují jejich ubikvitinaci, čímž je označují pro následnou degradaci. Největší skupinu ubikvitin ligáz tvoří vícepodjednotkové cullin-RING ubikvitin ligázy. Navzdory významnému pokroku v pochopení jejich molekulární architektury, sestavení a regulace zůstávají substráty a funkce většiny z nich neznámé. Tato práce se zabývá dvěma ubikvitin ligázami z podrodiny cullin-RING ubikvitin ligáz 4 (CRL4) - CRL4DCAF4 a CRL4DCAF12 . Za účelem identifikace jejich potenciálních substrátů a určení jejich biologických rolí bylo použito několik odlišných přístupů. S využitím proteomického přístupu jsme identifikovali širokou škálu potenciálních substrátů. Následně byla provedena podrobná charakterizace identifikovaných interakcí a testování podmínek, za kterých potenciální substráty podléhají degradaci. Nakonec byly za účelem odhalení fyziologické role CRL4DCAF4 a CRL4DCAF12 připraveny lidské buněčné linie a myší modely s vyřazeným genem pro DCAF4 a DCAF12. Zde prezentovaná identifikace a validace nových substrátů CRL4DCAF4 a...

Selective protein degradation by the ubiquitin-proteasome system is essential for cellular homeostasis and the regulation of diverse biological processes. The selectivity of this system is imparted by hundreds of ubiquitin ligases that specifically recognise substrates and catalyse their ubiquitination, thereby targeting them for degradation. Among ubiquitin ligases, multisubunit cullin-RING ubiquitin ligases constitute the largest group. However, despite significant advances in understanding their assembly, regulation, and molecular architecture, the substrates and functions of most of them remain unknown. This thesis focuses on two ubiquitin ligases from the cullin-RING ubiquitin ligase 4 (CRL4) subfamily: CRL4DCAF4 and CRL4DCAF12 . To identify their candidate substrates and to address their biological roles, several different approaches have been employed. First, proteomic screening revealed a wide range of candidate substrates. Next, detailed characterisation of the identified interactions and exploration of the condition under which candidate substrates undergo degradation was performed. Finally, knockout human cell lines and mice with a targeted disruption of genes encoding DCAF4 and DCAF12 were generated to explore the physiological roles of CRL4DCAF4 and CRL4DCAF12 . In summary, the herein...