Automatické monitorování uvolnění Metridia luciferázy z geneticky modifikované buněčné linie

Abstract

Charles University Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of: Analytical Chemistry Candidate: Natali Jozičová Supervisor: doc. PharmDr. Hana Sklenářová, Ph.D. Consultant: prof. Manuel Miró Title of the diploma thesis: Automated monitoring of Metridia luciferase released from genetically modified cell line. The diploma thesis reports automatic real-time monitoring of the release of Metridia luciferase from genetically modified cells. A previously optimized method for monitoring the natural release of luciferase from cells was used during the experiment. At the same time, the toxic effect of bile acids (chenodeoxycholic and deoxycholic acid) on changes in cell membrane permeability was tested. Liver epithelial cell line modified with the Metridia luciferase plasmid were used during the experiment. After this genetic modification, the cells were able to synthesize the active Metridia luciferase enzyme. This enzyme generates luminescence upon reaction with substrate coelenterazine. The emitted light was detected in the flow cell of a spectrofluorometer at a wavelength of 485 nm. The measurement was taken in a sequential injection system connected to a 3D printed module containing an insert with the tested cell monolayer. This automated system allowed real-time monitoring of the luciferase...

Univerzita Karlova Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra: Analytické chemie Kandidát: Natali Jozičová Školitel: doc. PharmDr. Hana Sklenářová, Ph.D. Konzultant: prof. Manuel Miró Název diplomové práce: Automatické monitorování uvolnění Metridia luciferázy z geneticky modifikované buněčné linie. Diplomová práce se zabývá automatickým monitorováním uvolněné Metridia luciferázy z geneticky modifikovaných buněk v reálném čase. Během práce byla použita již dříve optimalizovaná metoda pro monitorování přirozeného přebytku luciferázy z buněk. Zároveň byl testován toxický účinek žlučových kyselin (chenodeoxycholové a deoxycholové) na změny permeability buněčné membrány. Během experimentu byly použity jaterní epiteliální buňky, které byly modifikovány Metridia luciferázovým plazmidem. Po této genetické modifikaci byly buňky schopny syntetizovat aktivní enzym Metridia luciferázu. Tento enzym vykazuje po reakci se substrátem koelenterazinem luminiscenci. Emitované záření bylo následně detekováno v průtokové cele spektrofluorimetru při vlnové délce 485 nm. Měření bylo provedeno za pomocí sekvenční injekční analýzy, která byla propojena přes průtokový systém s 3D tištěnou celou, jenž obsahovala insert s testovanou monovrstvou buněk. Toto propojení umožnilo automatické monitorování uvolňování luciferázy...