Study of de novo purine synthesis in model systems of Caenorhabditis elegans and HeLa cell lines

Abstract

Purines are involved in many biologic processes and are required to maintain stable energy charge, for metabolic regulation, as cofactors in enzymatic reactions and as building blocks in DNA and RNA. Necessary role in purine synthesis is played by de novo purine synthesis (DNPS) that is highly active in developing cells. DNPS is complex pathway involving enzymes that assemble into multienzyme complex, purinosome, which facilitates flux of purine intermediates through sequence of ten enzymatically catalyzed reactions. Properly functioning enzymes and purinosome ensure the fast flux of unstable and potentially cytotoxic intermediates resulting in final product IMP, the branch point for AMP and GMP synthesis. The mutations in DNPS genes lead to inherited rare disorders that are accompanied by elevated concentrations of enzyme substrates in body fluids and cells. Lack of a suitable model system to study pathophysiology of DNPS raised the necessity to develop a system mimicking DNPS disorders. HeLa cells with malfunctioning DNPS were characterized on the level of genes, transcripts, proteins, metabolites, and for the presence of the purinosome. Homozygous or compound heterozygous mutations led to the absence of proteins, decreased enzymatic activities, accumulation of enzyme substrates, downregulation...

Puriny jsou součástí mnoha biologických procesů a jsou nezbytné pro udržování energetické homeostázy, regulaci metabolismu, syntézu DNA a RNA a slouží také jako kofaktory enzymatických reakcí. Důležitou roli v purinové syntéze hraje de novo purinová syntéza (DNPS), která je zvláště důležitá pro proliferující buňky. DNPS je komplexní dráha zahrnující šest enzymů, které tvoří multienzymový komplex, purinosom. Purinosom umožňuje pohyb purinových meziproduktů prostřednictvím deseti sekvenčních reakcí. Správně fungující enzymy a purinosom zabezpečují rychlý pohyb nestabilních a potenciálně cytotoxických meziproduktů až k finálnímu produktu IMP, výchozímu bodu pro syntézu AMP a GMP. Mutace v genech kódujících DNPS enzymy vedou ke vzniku dědičných vzácných onemocnění, které jsou doprovázeny zvýšenou koncentrací substrátů daného enzymu v tělních tekutinách a buňkách. Pro studium patofyziologie DNPS byl vyvinut modelový systém v HeLa buněčných liniích defektních v jednotlivých genech DNPS. Tyto buňky byly analyzovány na genové, transkripční, proteomické, metabolomické a funkční úrovni. Byly potvrzeny homozygotní a složené heterozygotní mutace vedoucí k absenci proteinu, snížení enzymové aktivity, akumulaci substrátu enzymu, sníženému přepisu v GART a PFAS genech a ke sníženému formování purinosomu. Dynamika...