Rekombinantní exprese, purifikace a charakterisace povrchového imunoreceptoru CD47 (integrin associated protein)

Abstract

Lidský imunoreceptor CD47, taktéž označovaný "Intergrin Associated Protein" je jedním z nových terapeutických cílů v léčbě rakoviny. Při interakci s proteinem nacházející se na buňkách imunitního systému (SIRP), dochází k inhibici fagocytického pohlcení buňky exprimující CD47. Tento mechanismus využívají nádorové buňky pro únik imunitnímu systému a činí tak CD47 nadějným cílem imunoterapií. V literárním přehledu této práce je charakterizován protein CD47 z hlediska struktury, lokalizace a funkce. Zároveň je detailně rozebraná interakce této bílkoviny se zmíněným SIRP a existující terapie cílící na CD47. Následující experimentální část se věnuje přípravy plazmidu pTT28_hCD47. Je popsáno, jak do linearizovaného vektoru pTT28 byl začleněn gen pro extracelulární část lidského proteinu CD47, který byl transfekován do savčího buněčného systému pro jeho produkci. Dále je popsaná purifikace rekombinantního proteinu afinitní purifikací na Ni­ NTA agarose a gelovou permeační chromatografií, kdy byly izolovány proteiny CD47 lišící se v glykosylacích. Jejich funkčnost byla úspěšně ověřena na přístroji SPR vazbou komerční protilátky. Experimentální část se dále zaměřuje na metody průtokové cytometrie využité pro evaluaci exprese proteinu CD47 na buněčných linií U937, THP­1, U251 a HEK­293, které jej všechny...

The human immunoreceptor CD47, also designated <Integrin Associated Protein= is a novel therapeutic target for cancer treatment. When bound to one of its ligands, a protein found on the surface of immune cells, SIRP, the phagocytosis of the CD47 expressing cell is inhibited. This interaction is used by malignant cells to escape detection by the immune system, thus making CD47 a promising candidate molecule for cancer immunotherapy. The literary overview focuses on the characterisation of CD47 in terms of its structure, localization, and function. Additionally, this sections thoroughly delves into the aforementioned interaction with SIRP as well as existing mechanisms for the targeting of the CD47- SIRP axis. The following experimental section centers around the preparation of the plazmid pTT28_hCD47. The process by which the gene for the extracellular portion of human CD47 was inserted into the linearized pTT28 vector is noted and its transfection into a mammalian expression system to produce the protein. Moreover, the section divulges into the purification of the recombinant protein by affinity purification using Ni-NTA agarose as well as gel permeation chromatography, resulting in the isolation of CD47 proteins differing in glycosylation. Their functionality was validated via SPR, in a study...