Reorganization of in vitro reconstituted actin-based networks

Abstract

Cytoskelet poskytuje živým organismům nástroje k pohybu. V molekulárním měřítku procházejí stejné složky cytoskeletu neustálou reorganizací, aby přispívaly k různým buněčným procesům, jako je například navigace neuronálních růstových kónů v procesu vývoje mozku nebo vytváření chirálních aktinových toků během buněčného dělení. Během vývoje mozku je navigace neuronálních růstových kónů umožňena vzájemými interakcemi mezi sítěmi aktinových vláken a mikrotubuly (v angličtině "cytoskeletal crosstalk"). V růstových kónech byla část těchto intra-cytoskeletálních interakcí spojena s významnou mikrotubulární polymerázou CKAP5 (homolog XMAP215, MSPS, Zyg9). Nicméně role CKAP5 v molekulárním mechanismu remodelace mikrotubulů i aktinových sítí zatím nebyla objasněna. K lepšímu pochopení molekulárího mechanismu jsme použili fluorescenční mikroskopii s úplným vnitřním odrazem (TIRF, z angl. "total internal reflection fluorescence") v kombinaci s in vitro rekonstituovanými mikrotubuly a sítěmi aktinových vláken, které jsme pozorovali v přítomnosti rekombinantních proteinů. V této práci ukazujeme, že CKAP5 vytváří svazky z aktinových vláken (jak náhodně, tak paralelně orientovaných), propojuje aktinová vlákna s mikrotubuly bez ohledu na jejich polaritu, a dále umožňuje umístění aktinových svazků podél "šablon" z...

The cytoskeleton provides living organisms with machinery to move. On the molecular scale, the same cytoskeletal components undergo constant reorganization to contribute to distinct cellular processes, such as the navigation of neuronal growth cones in brain development or the creation of chiral actin flows during cellular division. During brain development, neuronal growth cones navigate by employing cytoskeletal crosstalk between actin filament networks and microtubules. Crosstalk in the growth cones between these cytoskeletal components was linked with known microtubule polymerase human cytoskeleton associated protein 5 (CKAP5; homolog of XMAP215, MSPS, Zyg9), while the details of the direct molecular mechanism of CKAP5-provided remodeling of both microtubules and actin networks are lacking. Therefore, we used total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy together with state- of-the-art in vitro reconstituted assays combining microtubules, actin filament networks, and recombinant proteins to understand cytoskeleton-provided molecular mechanisms underlying cellular motion. In this thesis, we show that CKAP5 alone bundles both supposedly randomly oriented and parallel actin filaments, crosslinks actin filaments to microtubules regardless of their polarity, positions prevailing actin...