Introducing of an experimental approach to study mitotic translation in human cell lines.

Abstract

The biological role of eIF4E2, translation initiation factor, remains unexplored in mitosis. To better understand its role in mitotic translation regulation, I established, with validations, RPE-1 stable cell lines with inducible expression of eIF4E2 tagged with GFP and 3XFLAG respectively. I also created similar cell lines with inducible expression of eIF4E with identical tags, for comparison. I further performed a pilot LC-MS/MS experiment with GFP- and 3XFLAG-eIF4E proteins immunoprecipitated from G2, M, and G1 cell cycle phase of these RPE-1 cells. However, mass spectrometry and Western blot analyses identified only eIF4G translation initiation factor as specific eIF4E-interacting protein, indicating a likely stringent immunoprecipitation condition. Furthermore, to study the gene-specific translation regulation in mitosis, I took advantage of the ribosome profiling study by Tanenbaum et al. (2015) and selected 10 transcripts with differential translation efficiency (TE) upon mitotic entry. In the two biological replicates of polysome profile of G2, M and G1 conducted, decreased TE of PPP1CC and ARHGAP5 in mitosis was confirmed, whereas a similar trend in TE of MCM2, MCM5 and CDT1 mRNAs was observed in one replicate. The reliability of the qRT-PCR based approach for mRNA TE calculation can be...

Biologická funkce translačního iniciačního faktoru eIF4E2 v mitóze zatím nebyla studována. K lepšímu pochopení jeho možne role v regulaci mitoticke translace jsem vytvořila dvě stabilní linie RPE-1 s inducibilní expresí fúzního proteinu GFP-eIF4E2, respektive eIF4E2-3XFLAG. Další dvě linie s inducibilní expresí proteinu eIF4E se stejnými proteinovými značkami jsem vytvořila pro budoucí porovnání spektra interagujících proteinů. Pilotní experiment s proteiny GFP-eIF4E a eIF4E-3XFLAG imunoprecipitovanými z buněčných lyzátů získaných z buněk RPE-1 v G2, M a G1 fázích buněčneho cyklu a následná analýza pomocí hmotnostní spektrometrie a Western blotu však ukázaly, že jako jediný protein, který specificky interagoval s eIF4E, jsem identifikovala translační iniciační faktor eIF4G, což naznačuje, že jsem aplikovala příliš stringentní podmínky imunoprecipitace. Pro budoucí studium genově-specificke regulace translace jsem vybrala 10 mRNA s rozdílnou translační účinností (TE) po vstupu buněk do mitózy z dat publikovaných kolektivem Tanenbaum et al. (2015). Provedla jsem polyzomove profilování buněčných kultur ve fázích G2, M a G1. Potvrdila jsem snížení TE pro mRNA kódující PPP1CC a ARHGAP5 v mitóze; zvýšení TE pro mRNA MCM2, MCM5 a CDT1 v mitóze bylo zaznamenáno v jednom ze dvou biologických replikátů. Pro...