Charakterizace a využití chromatografických módů s více interakčními mechanismy

Abstract

The presented dissertation thesis focuses on the detailed characterization and utilization of various modes of liquid chromatography with multiple interaction mechanisms for analysis of biologically active compounds, such as peptides, proteins or therapeutic oligonucleotides. In the first part of the thesis, the retention/interaction mechanisms of selected reversed-phase and mixed-mode stationary phases were investigated thoroughly, with a strong emphasis on describing electrostatic interactions. For their detailed characterization, new method using pure aqueous mobile phases with different pH values and model permanently charged analytes (including inorganic anions) was developed. It's important to note that electrostatic interactions can be arise not only from the presence of ligands with ion-exchange properties (mixed-mode stationary phases) but also from residual dissociated silanols. To describe the retention behavior of peptides and proteins, i.e. zwitterionic compounds, stationary phases with mixed-mode character were selected. The retention and peak shape in these systems are fundamentally affected not only by pH of aqueous part of the mobile phase, but also by the buffer concentration. With the aim of developing a simple method for on-line protein digestion, chromatographic columns with...

Předkládaná disertační práce se zabývá podrobnou charakterizací a využitím různých módů kapalinové chromatografie s více interakčními mechanismy pro analýzu biologicky aktivních látek, jako jsou například peptidy, proteiny nebo terapeutické oligonukleotidy. V první části práce byl detailně studován retenční/interakční mechanismus vybraných reverzních a mix-mód stacionárních fází, a to s velkým důrazem na popis elektrostatických interakcí. Pro jejich detailní charakterizaci byla vyvinuta nová metoda využívající čistě vodné mobilní fáze s různými hodnotami pH a modelové permanentně nabité analyty (včetně anorganických aniontů). Bylo ukázáno, že elektrostatické interakce mohou být důsledkem přítomnosti nejen ligandu s iontově výměnným charakterem (na mix-mód stacionárních fázích), ale i residuálních disociovaných silanolových skupin. Pro popis retenčního chování peptidů a proteinů, tedy analytů zwitterionické povahy, byly vybrány stacionární fáze s mix-mód charakterem. Retence i tvar píků v těchto systémech jsou zásadně ovlivněny nejen pH vodné složky mobilní fáze, ale také koncentrací pufru. S cílem vyvinout jednoduché metody pro on-line štěpení proteinů byly charakterizovány chromatografické kolony s imobilizovaným trypsinem z hlediska vlivu chromatografických podmínek (teplota, pH mobilní fáze,...