Betasekretasa: Produkce a in vitro testování inhibitorů.

Abstract

Charles University Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Biological and Medical Sciences Candidate: Bc. Barbora Hejtmánková Trainer: PharmDr. Miroslav Kovařík, Ph.D. Consultant: RNDr. Martina Hrabinová, Ph.D. Title of the master thesis: Beta-secretase: production and in vitro testing of inhibitors. Beta-secretase 1 plays a major role in the amyloid hypothesis in Alzheimer's disease pathogenesis. Non-physiologically β-secretase together with γ-secretase cleaves amyloid precursor protein and is responsible for the production of amyloid beta peptides (Aβ1-42), which accumulates in extracellular space and creates amyloid plaques. These are recognized by immune systems as antigens. Inflammatory response, which appear, can lead into neurodegeneration. Alzheimer's disease is a complex multifactorial progressive disease which cause cognitive decline. Due to fatal consequences a patient depends on the care of other family members. This master thesis aims to own expression, purification, and validation of recombinant β- secretase 1. It's purification was made using Ni-NTA agarose. Concentration of protein was defined for characterization. For identification, a western blot method was used. Recombinant β-secretase was used for experimental in vitro inhibition efficiency determination of 19...

Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biologických a lékařských věd Kandidát: Bc. Barbora Hejtmánková Školitel: PharmDr. Miroslav Kovařík, Ph.D. Konzultant: RNDr. Martina Hrabinová, Ph.D. Název diplomové práce: Betasekretasa: Produkce a in vitro testování inhibitorů Betasekretasa 1 hraje klíčovou roli v amyloidní teorii vzniku Alzheimerovy choroby. Kde za patologických podmínek společně s γ-sekretasou štěpí amyloidový prekurozorový protein za vzniku amyloidu β (Aβ1-42), který se hromadí v extracelulárním prostoru mozku ve formě amyloidových plaků. Ty jsou rozeznány imunitním systémem jako antigeny a vzniká zánětlivá reakce vedoucí až k neurodegeneraci. Alzheimerova choroba je závažné onemocnění projevující se narušením kognitivních funkcí. Je to progresivní onemocnění, které má fatální následky a váže postiženého jedince k péči ostatních členů rodiny. Tato diplomová práce zahrnuje produkci, purifikaci a validaci vlastního enzymu β- sekterasy 1. Purifikace byla provedena s využitím Ni-NTA agarózy. K jeho charakterizaci byla určena koncentrace proteinu a k identifikaci byla použita metoda western blot. Rekombinantně připravená β-sekretasa 1 byla použita pro in vitro stanovení inhibiční účinnosti u 19 vybraných látek pomocí fluorescenční spektrofotometrické metody....