Genome engineering in vivo for modeling of human diseases enhanced by AVV technology

Abstract

(CZ) Rekombinantní adeno-asociovaný virus (rAAV) je vektor s širokou aplikací v základním a klinickém výzkumu, zejména díky své neintegrační povaze, robustní dlouhodobé expresi a nízké imunogenicitě. Tato disertační práce představuje několik inovativních přístupů v aplikaci a produkci rAAV pro transgenní praxi, přičemž řeší klíčové výzvy v oblasti vývoje modelů, konverze alel a škálovatelné produkce. Cílem práce je rozšířit potenciál rAAV v genetickém výzkumu, zejména při tvorbě myších modelů a optimalizaci systémů transferu genů. Hlavním úspěchem bylo vyvinutí rychlého, humanizovaného myšího modelu pro výzkum SARS-CoV-2, který byl klíčový během pandemie COVID-19. Tento model umožnil efektivní testování bispecifických protilátek a poskytl cenné srovnání s jinými transgenními modely pro výzkum SARS-CoV-2 infekcí. Disertační práce rovněž představuje zjednodušenou metodu přímé konverze alel v zygotách ex vivo pomocí rAAV, což vede ke zkracení doby chovu a počtu potřebných zvířat pro dosažení cílového genotypu, což je v souladu s principy 3R v oblasti výzkumu na zvířatech. Dále byla v rámci této práce vyvinuta nová metoda produkce rAAV, která využívá extracelulárních vesikulů (EV) jako biologické matrice. Metoda spočívá v produkci složeného vektoru EV-AAV (EV-asociovaný AAV) a nabízí efektivnější a...

(EN) Recombinant adeno-associated virus (rAAV) is an emerging vector with broad applications in basic research, particularly due to its non-integrative nature, robust long-term expression, and low immunogenicity. This dissertation presents several innovative advancements in the application and production of recombinant adeno-associated virus (rAAV) for transgenic practices, addressing key challenges in model development, allele conversion, and scalable production. The research aims to expand rAAV's potential in genetic research, particularly in creating mouse models and optimizing gene delivery systems. A major achievement was the development of a rapid, responsive mouse model for SARS-CoV-2 research, crucial during the COVID-19 pandemic. This model facilitated efficient testing of bi-specific antibodies and provided a valuable comparison to other transgenic models for viral infections. Additionally, the dissertation introduces a streamlined method for direct allele conversion in zygotes using ex vivo rAAV treatment, reducing breeding time and genotyping efforts. This approach supports the 3R principles of animal research by minimizing the number of animals required. Furthermore, a novel rAAV production method was developed, utilizing extracellular vesicles (EVs) as a biological matrix for scalable...