Chemická enukleace u savčích oocytů

Abstract

Předchozi techniky enukleace byly nepřesne a časově naročne. Často se využiva barveni jaderne DNA pomoci Hoechstu, přičemž je barvivo pro oocyt jedovate a ma vliv na jeho dalši vyvoj.Chemicka enukleace je metoda, ktera usnadni vznik cytoplastů ve většim množstvi a v kratšim čase. Budoucnost chemicke enukleace se nachazi na poli biotechnologickem, a to zejmena v oblasti jaderneho přenosu (terapeuticke, reprodukčni klonovani). Chemicka enukleace byla uspěšně provedena u několika modelovych zviřat:myš, ovce, skot. Avšak u prasat je tato technika stale vylepšovana, vzhledem k podobnosti s člověkem, kde by se měla později uplatnit. Bylo zjištěno, že u každeho druhu působi stejne chemikalie jinym způsobem na oocyt a tudiž je nutne zkoumat každy druh zvlašť.Proto byly hledany chemicke latky působici na praseči oocyty, tak aby došlo k vytvořeni vystupku obsahujiciho chromozomy (protrusion). Jako nejvhodnějši pro chemickou enukleaci jsme stanovili demekolcin v koncentraci 0,4 Ug/ml a doba působeni 30 minut (ktery zastavuje polymeraci tubulinu). Dale cytochalasin B v koncentraci 7,5 Ug/ml a doba působeni 10 minut. Uspěšny vznik vystupku obsahujiciho chromozomy (protrusion) koreluje s kvalitou oocytů. Dale jsme se zaměřili na distribuci mitochondrii po fuzi enukleovaneho a neenukleovaneho oocytu. Rovnoměrnou...

The common techniques of enucleation are inexact and time-consuming. Nuclear DNA staining with Hoechst is frequently used, whereas the staining agent is toxic for the oocyte and has negative impact on its further development. Chemical enucleation is a method which facilitates the production of cytoplasts in higher amount and shorter time. Chemical enucleation has a potentional use in the field of biotechnology, especially in nuclear transfer methods (therapeutical, reproductive cloning). The chemical enucleation was successfully used on several model animals: mouse, sheep, cattle. The technique is beeing continually improved on pigs, regarding their similarity to human where it should be consequently applied. It was discovered that same chemicals have different effect on oocytes of each species and therefore it is necessary to examine each species separately. In our study we use porcine oocytes for chemical enucleation. We determined demekolcine in concentration 0,4 Ug/ml and acting time 30 minutes as the most suitable for chemical enucleation. Furthermore we used cytochalasin B in concetration 7,5 Ug/ml and acting time 10 minutes. The protrusion rate correlates with quality of oocytes. In other experiment we focused on distribution of mitochondria after fusion of normal and enucleation oocyte. We found...