Production and purification of recombinant human xenobiotic nuclear receptors

Abstract

Předložená diplomová práce se zabývá produkcí a purifikací rekombinantních lidských xenobiotických jaderných receptorů (NRs). Důraz je kladen na ligand- vazebnou doménu (LBD) lidského konstitutivního androstanového receptoru (hCAR) a lidského pregnanového X receptoru (hPXR). Tyto receptory patří do podskupiny NR1I jaderných receptorů a slouží k regulaci metabolismu léčiv. Významnou roli hrají u mnoha lidských nemocí, jako je zánětlivé onemocnění střev nebo diabetes a obezita. V rámci práce byly cDNA rekombinantních proteinů sloužící pro produkci hCAR a hPXR LBD klonované do bakteriálního expresního vektoru pET-15b od Novagenu. Získané plasmidy byly pomnoženy v kompetetivních buňkách E. coli kmene DH5. K ověření správnosti vložených inzertů sloužila technika PCR a restrikční analýza velikosti fragmentů na agarózových gelech. Vhodné izolované klony byly následně transformovány do kompetetivních buněk E. coli kmene BL21 DE3 a rekombinantní protein byl připraven za optimálních podmínek v expresním systému za použití regulace pomocí koncentrace isopropyl-1-thio--D- galactopyranosidu (IPTG). Produkce hCAR LBD a hPXR LBD byla sledována při definovaných koncentrací IPTG, teplotě a buněčné hustotě (OD600). Z výsledků vyplynuly optimální podmínky pro proteinovou produkci; hCAR LBD byla dosažena při 0.75 mM...

The submitted thesis deals with the production and purification of recombinant human xenobiotic nuclear receptors (NRs). This study was focused on the production of ligand - binding domains (LBDs) of human constitutive androstane receptor (hCAR) and human pregnane X receptor (hPXR). These receptors belong to the subfamily NR1I NRs and serve as key regulators of drugs metabolism. They are also implicated in many human diseases such as inflammatory bowel disease or diabetes and obesity. The cDNA of recombinant proteins, which serves for production of hCAR and hPXR LBDs, was cloned into bacterial expression vector pET-15b (Novagen). The gained constructs were propagated in E. coli cells of DH5 strain. The isolated plasmids were analyzed after colony PCR and restriction analysis for the correct insert on agarose gels. The clones with correct inserts were subsequently transformed into E. coli cells strain BL21 DE3 and recombinant protein was synthesized in expression system, which was regulated by concentration of isopropyl-1-thio--D-galactopyranosid (IPTG) under optimal conditions. Production of hCAR and hPXR LBD was observed in defined concentrations of IPTG, temperatures and cell densities (OD600). The results revealed the following optimal conditions for protein production; for the hCAR LBD it was...